194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 E. coll HBlOl-t a fenti módon elkülönített Hlf-4C-vel transzformálunk. Hat tetraclklln rezlsztens, transzformált baktériumot oldunk, kis kultúrákat készítünk és a 1 DNS-t az előzőekben ismertett módszerrel tisztítjuk és Pst I-gyel való hasítással, valamint agaróz gélen végzett elektroforézissel analizáljuk. Valamennyi minta Hif-4C-vel azonos hasítási terméket eredményez. Az újraklónozott rekombináns DNS molekulák egyikét Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4c (Hif-4c) szimbólummal jelöljük és a további kísérletekben ezt használjuk. Az újraklónozott DNS-re utal a c betű. Abból a célból, hogy Hif-4c és cDSN inzertjeinek lFN-amRNS-hez történő hibridizációs képességét meghatározzuk, 115 /tg Hif-4x t 125 egységnyi Pstl-gyel teljesen elemésztjük, fenollal és kloroformmal extraháljuk, és etanollal a fenti módon kicsapjuk. 10 I*g-nyi alikvot részének 5 helyzetét a következő módon jelezzük (abból a célból, hogy a következő lépésekben nyomjelzőként szolgáljon). 100 ri 50 rnmólos Trisz-HCl ben (pH = 7,5) feloldjuk, 0,1 ml-es Chelex 100 típusú oszlopon bocsátjuk át 1 órán át és 65°C hőmérsékleten 0,6 egységnyi bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeljük. Ezután tízszeresen koncentrált 40 fl TNE-t adunk hozzá és az oldatot háromszor 1 térfogatrész fenollal és háromszor 1 térfogatrész kloroformmal extraháljuk. A DNS-t 2 térfogatrész etanollal -20°C-on éjjelen át kicsapjuk és centrifugálással összegyűjt ük. További tisztítás céljából 0,5 ml TNA-ban feloldott mintát 0,25 ml-es DEAE cellulózon (Whatman DE52 típusú, melyet előzőleg 2 ml, 150 mmól/liter NaCl-t, 50 mmól/liter Trisz HO-t (pH = 7,5) és 2 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal (NET puffer) mossuk meg) adszorbeáljuk, 2 ml NET-pufferrel mossuk, 0,4 ml 1.5 mól/Hter NaCl-t. 20 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5) és 2 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal eluáljuk és etanollal a fenti módon kicsapjuk. A DNS-t 7-3íP-ATP-vel (fajlagos aktivitása kb. 5000 Cl/mmól) és polinukleotid kinázzal inkubáljuk (A. M. Maxam és W. Gilbert „A New Method for Sequencing DNA , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 o. (1977)) és 3 ml-es Scphadex-G50 oszlopon TNE-vel végzett kromatogafálással tisztítjuk. A frakciókat egyesítjük és a 33P DNS-t a fenti módon etanollal leválasztjuk, a hozam kb. 101 bomlás/perc. 90 trg nem jelzett, Pstl-gyel hasított Hif-4c DNS-t 6x10* bomlás/perc SÍP-vel jelzett, Pstl-gyel hasított, a fenti módon kapott Hif-4c DNS-sel összekeverünk és 10x20x0,7 cm-es, 2%-os vízszintes agaróz gélen, (50 rnmólos Trisz-acetát pufferban (pH = 7,8) 2.5 cm-es csíkot használva elektroforizáljuk. Ezután gélre helyezett röntgen filmmel a 320 b.p.-t tartalmazó fragmens helyzetét meghatározzuk. A radioaktív sávot (1.3x10* dpm) tartalmazó gélcsíkot kivágjuk, és egy 2 ml-es plasztik fecskendőn történő átnyomással összepréseljük, majd éjjelen át 4°C hőmérsékleten a gél térfogatára vonatkoztatott tízszeres térfogatú NET pufferrel való keveréssel extraháljuk. A DNS-t 0,1 ml-es hidroxi-apatlt oszlopon (melyet előzőleg 1 ml NET pufferrel mosunk meg) adszorbeáljuk. Az oszlopot 1 ml 0,1 mólos K- foszfát pufferrel (pH = 7,5) mossuk meg, és a DNS-t 0,2 ml 1 mólos K-foszfát pufferrel (pH = 7,5) eluáljuk. Az eluátumot steril desztillált vízzel tízszeresére hígítjuk, és a DNS-t DEAE-re adszorbeáljuk és arról eluáljuk, majd a fenti módon etanollal csapjuk ki. Az így kapott DNS-fragmenset Hif-4c fragmensnek nevezzük. 120 ng Hif-4c fragmenst DPT papírhoz (0,5 x 0,5 cm-es méretű) (a fenti módon) kötünk. Kontrollként Z-pBR322(H3)Rc0G4.13 hibrid plazmidból Hind Hl-mal kivágott 120 ng súlyú ß-gjobin cDNS fragpienst használunk [F. Meyer Vector To Another , Experimentia, 35, 972 o. (1979), N. Mantei et al. fenti közleményük) és azzal hasonló műveleteket végzünk. A kettős szűrők poli(A)RNS-sel (20 flben) történő hibridizációját, a szűrők kimosását és az RNS szűrőkről történő visszanyerését a fenti módszerrel végezzük. Oocitákba történő injektálást követően az IFN-aaktivitást meghatároztuk. DNS fragmens leukocita hibridizá IFN-a akpoli(A)dós idő tiv (NE/ RNS* (óra ml)** ketmennyitős vizsgásége (fig) gálat Hif-4c 2,5 16 250 : 100 ß-globin cDNS 2,5 16 4 : 1 Hif-4c 7.5 16 3000:1000 ß-globin cDNS 7,5 16 4 :30 Hif4c 7,5 5 1000:1000 ß-globin cDNS 7,5 5 10 : 1 •Ennek az RNS-nek 1 pg-ja 4600 NE/ml-t eredményez. ** Oodta-felülúszó 48 h inkubációt követően, melyet a citopatlkus hatás csökkenése alapján hatá rozunk meg (W. E. Stewart IT és S. E. Sulkin - fenti közleményük) Ily módon Hif-4c az IFN-ctmRNS-sel hibridizációra képes inszertet tartalmaz. Hif-4c-ben lévő inszerttel kereszt-hibridizáció rekombináns DNS molekulákat tartalmazó E. coli kiónok azonosítása Mivel a Hif-4c rekombináns DNS molekulában lévő cDNS inszert kb. 320 b.p.-t tartalmaz, vagyis egyharmada az IFN-amRNS körülbelüli nagyságának, a fentiekben leírt tisztított Hif-4c fragmenst a hibrid DNS inszerteknek megfelelő rekombináns DNS molekulákat tartalmazó bakteriális kiónok szkrinelésében tesztanyagként használjuk (3. ábra) A X-III alcsoportot (melyet a fentiekben ismertettünk alkotó 64 bakeriális kiónt 8 cm átmérőjű Millipore membránra préseljük, majd agar lemezre (melyet a fenti módon (36. oldal 14-16. sor diaminopimelin-sawal, nalidixsawal, és tetraciklinnel egészítünk ki) helyezzük és 37°C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. A szűrőt 0,75 ml-es 0,5 móllos NaOH cseppre helyezzük és 2-3 perc múlva papírra helyezve a felesleges folyadékot leitatjuk: majd e műveletet ismételjük. A szűrőt semlegesítjük 1 mólos Trisz-HCl-lel (pH = 7,5) és a fentiekhez hasonlóan 1,5 mól/liter NaG 0,5 mól/liter Trisz-Hcl (pH = 7,4) oldattal mossuk, majd légszárazra szárítjuk és 80°C hőmérsékleten 2 ólán át vákuumban melegítjük. 30 ng Hif-4c Pst fragmenst ß-slPdATP-t és o-3íP dCTP-t (mindkettő fajlagos Aktivitása 40 Ci/mmól) használva „nick-transzlációval 31P-vel jelzünk [A. J. Jeffreys és R. A. Flavell, „The Rabbit ß-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Sequence’, Cell, 12, 1097-1108 o. (1977)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
