194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 A találmány DNS szekvenciákra, rekomblnáns DNS molekulákra, továbbá Interferon és Interferonszerű pollpeptidek előállítási eljárására, közelebbről megfelelő gazdaszervezetekben expressziált DNS szekvenciákra vonatkozik. A találmány tárgyát képező rekomblnáns DNS molekulák szekvenciái immunbiológjailag vagy biológiailag hatásos humán leukocita interferon molekulákat kódolnak. A találmány szerinti DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és előállítási eljárások révén vírus- és tumor- vagy rákellenes pollpeptjdeket kapunk. A továbbiakban a Nature-ben {286, 2421 o. [1980. július 10.]) ismertetett interferon-nomenklatúrát használjuk, mely a korábbi bejelentéseikben használtat is helyettesíti, pl. az IF jelölésnek az IFN és a leukocita interferonnak az IFN-a szimbólum felel meg. Az interferonok (IFN) két különböző osztálya ismeretes; az I. osztályba tartozó interferonok kicsiny, sav stabilis glikoproteinek, melyek a sejtek vírus fertőzésekkel szembeni rezisztenciáját biztosítják [A. Isaacs és J, Lindenmann, „Virus Interference I. The Interferon , Proc. Royal Soc. Ser. B., 147, 258-67. o. (1957) és W. E. Stewart, II. The Interferon System, Springer-Verlag (1979) továbbiakban „The Interferon System ]. Bár bizonyos mértékig sejtspecifikusak (The Interferon System, 135—45. o.), nem vírusspeciflkusak. Az IFN-k a vírusok széles spektrumával szemben védik a sejteket. A humán interferonokat (HuIFN) három csoportba — aj3 és 7 - soroljuk. A HuIFN-a vagy más néven -leukocita interferon a humán leukocita sejtekben, valamint kisebb mennyiségű HuIFN-/? (fibroplaszt interferon)-val együtt a limfoblasztoid sejtekben keletkezik. Tisztítással történő homogenizálást követően a HuIFN-a jellemzőit az irodalom ismerteti [pl. M. Rubinstein és társai, „Human Leukocyte Interferon: Production, Purification To Homogeneity and Initial Characterization Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 76, 640-44. o. (1979)], mely a molekulanagyság szempontjából - feltehetően a szénhidrát molekularész jelenléte miatt - heterogén. Két komponenst írnak le, melyek közül az egyik 21000- 22000, a másik 15000—18000 molekulasúlyú, és a kisebb molekulasúlyú komponens nem-glikozflezett formában van jelen. A HuIFN-a hatást teljesen vagy legnagyobb részben a HuIFN-a kisebb komponense hordozza. [W. E. Stewart, és társai., „Effect of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties of Human Leukocyte Interferon . Virology, 87, 473-76. o. (1979)]. A limboblasztoid sejtek HuIFN-a aminosav szekvenciájának egy részét és aminosav összetételét az irodalom ismerteti. [K. C. Zoon és társai, „Amino Terminal Sequence Of The Major Component of Human Lymphoblastoid Interferon’, Science, 207, 527-28. o. és M. Hunkapiller and L. Hood, előadás (1980)]. Ismeretes, hogy a HuIFN-a különböző formákban létezhet — pl. a 2 037 296A sz. brit szabadalmi leírás Ismertet ilyeneket, - amelyek úgy látszik, hogy szerkezetileg és fiziológiailag különböznek egymástól. A HuIFN-a-nak e formáira azonban nincs elfogadott nomenklatúra: Így a továbbiakban e komponeseket a HuIFN szimbólum után írt számmal jelöljük. A HuIFN-a - hasonlóan számos egyéb humán proteinhez - polimorf lehet. Így az egyes sejtek az általánosabb HuIFN-a csoporton belül fiziológiailag hasonló, de szerkezetileg - ahhoz a csoporthoz képest, amelyhez tartoznak - némiképpen különböző HuIFN-a-t termelhetnek. Ennélfogva amíg általában egy HuIFN-a fehérjeszerkezete jól definiált, addig az individuális HuIFN-a kissé különbözhet ettől, bár ez az allelikus változás valószínűleg a HuIFN-q különböző formál közötti különbségnél kisebb differenciát jelent. Az egészséges vagy normális sejtekben a HuIFN rendszerint nem mutatható ki (The Interferon System, 55-57. o ). Akkor keletkezik, ha a sejt IFN-induktorral kerül kapcsolatba. Az IFN-lnduktorok rendszerint vírusok, de lehetnek nem-vírus természetű anyagok is, mint például természetes vagy szintetikus kettős fonalú RNS molekulák, intracelluláris mikrobák, mlkrobiális eredetű anyagok és különböző kémiai ágensek. A humán sejteknek e nem-vírus természetű induktorokkal történő, vírus fertőzésekkel szembeni rezisztenssé tételére számos próbálkozás volt már [S. Baron és F. Dianzani (eds.) Texas Reports on Biology And Medicine, 35 („Texas Reports ) 528—40. o. (1977)], azonban ezek nem voltak túlságosan sikeresek. E helyett előnyösebb volt magának az exogén HuIFN-nek a használata. A vírus- és tumor- vagy rákellenes interferon terápiában különböző dózistartományokat és adagolás módokat alkalmaznak (The Interferon System, 305-321. o.). Például az interferont hatátosan orálisan, oltás formájában, - intravénásán, intramuszkulárisan, íntranazálisan, intradermálisan és szubkután — valamint szemcseppek, kenőcsök és spray-k alakjában adagolják. Általában naponta egy-háromszor 104—107 egységet adnak. A terápia a kezelt személytől és a kezelés körülményeitől függ. Például a vírusfertőzéseket napi egy vagy két dózissal, néhány nap és két hét közötti időtartamig, a tumorokat és rákos megbetegedéseket néhány hónapon vagy éveken át tartó napi egyszeri vagy többszöri dózissal kezelik. Nyilvánvalóan az adott beteg szempontjából legcélszerűbb terápiát a kezelőorvos határozhatja meg. ismervén a betegséget, a megelőző terápiát, valamint a különbözőképpen és különböző dózisokban adagolt interferonra kapott válaszreakciókat. A HuIFN-t antívirális ágensként a következő kórképekben használják: légzési infekciók (Texas Reports, 486-96. o.) herpesz szimplex keratitisz (Texas Reports, 497-500), akut hemorrhagiás konjuktivitisz (Texas Reports, 501—10. o.), varicella zoszter (Texas Reports, 511-15); citomegalovírus infekció (Texas Reports, 523—27. o.), és hepatitisz B (Texas Reports, 516-22. o.) esetén. További példákat hoz The Interferon System, 307-19. o. Azonban nagyobb mennyiségű IFN antívirális ágensként való felhasználáshoz az eddiginél nagyobb mennyiségére van szükség. A HuIFN vírusellenes hatásán kívül egyéb hatásokkal is rendelkezik. Például a kolónia stimuláló faktort antagonizálja, a hemopoltíkus kolónia-képző sejtek növekedését inhibitálja és beavatkozik a granulodta és makrofág prekurzorok normális differenciálódásába (Texas Reports, 343—49. o.). A DMSO-val kezelt Friend leukémiás sejtek eritroid differenciálódását szintén gátolja (Texas Reports 420—28. o.) A HuIFN továbbá szerepet játszik az immun-válasz regulációjában is. Az alkalmazott dózistól és az alkalmazás Idejétől függően, az antigénre vonatkoztatottan, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
