194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
194 303 3. példa: Brevibacteiium species DSM 2843-t (amelyet a 2. példában említettől eltérő istálló-mintából izoláltunk) tenyésztünk úgy, mint a Moraxellát a 2. példában. Előtenyészet 21 óra 28°C-on, OD 1 :20 = 0,690. Főtenyészet Tenyészidő (óra) OD 1 :20 NMH-áz egység/liter 10 15 0,440 26 24 0,550 80 39 0,670 59 43 0,750 4. példa 46 15 Micrococcus spec. DSM 2565-t (amelyet egy földmintából izoláltunk) tenyésztünk úgy, mint a Moraxellát a 2. példában. Előtenyészet 21 óra 28°C-on, OD 1 : 20 = 0,620. Főtenyészet OD 1 :20 Tenyészidő (óra) 24 27,5 NMH-áz egység/liter 53 83 0,690 0,800 5. példa 1. Enzimatikus szinteszt 1-metil-hidantoin meghatározására. ( 1 -Metfl-hidantoináz)N-karbamofl-szarkozin-amldohidroláz)szarkozin-oxidáz reakció peroxidáz(4- -amino-antipirin) 2,4,6-tribróm-5-hldroxi-benzoesav színindikátor-rendszerrel). 1.1 Reagensek Komponensek Koncentráció a reagensben TES.KOH (pH 7,8) Magnézium-klorid ATP Ammónlum-klorid 4-Amino-antipirin 2,4,6-tribróm-3-hidroxibenzoesav 1 -Metfl-hidantoináz N-karbamofl-szarkozin-amidohidroláz Szarkozin-oxidáz Peroxldáz 100 mmól/liter 5 mmól/liter 5 mmól/liter 10 mmól/liter 0,5 mmól/liter 5 mmól/liter 0,15 egység/ml 20 25 30 35 40 rációjú vizes oldatai. A AE függését a hozzáadott mintában lévő 1-metil-hidantoin mindenkori koncentrációjának függvényében az 1. ábrán ábrázoljuk. 6. példa: N-KarbamoÜ-szarkozin meghatározása az 5. példában szereplő 1,1 reagenssel. A meghatározás kivitelezése az 5. példa 1.2 pontjában leírtak szerint történik, c$ak a vizes 1-metü-hidantoin oldatok helyett történik, csak a vizes 1-metil-hidantoin oldatok helyett ekvimoláds koncentrációjú (87,7-1754 jumól/liter) N-karbamoB- szarkozin mintákat használunk a tesztben. A mért extinkcióértékeknek az N-karbamoflszarkozin koncentrációjától való függését a 2. ábrán mutatjuk be. Az 5. példa és a 6. példa szerint mért extinkcióértékek közötti összehasonlítás azt mutatja, hogy ekvimoláris koncentrációjú 1-metil-hidantoin és N-karbamoil-szarkozin minták esetében azonos mértékű elszíneződést mérünk (3. ábra). 7. példa Enzimatikus ultraibolya teszt 1-metil-hidantoin meghatározására. (l-MetÍl-hidantojnáz)piruvát-kináz-/laktát-dehidrogenáz-reakció). 7.1 Reagensek: 7.1.1.1. reagens: Komponensek Koncentráció a reagensben Kálium-foszfát (pH 8,0) NADH ATP Foszfoenol-piruvát Magnézium(II)-klorid Piruvát-kináz Laktát-dehidrogenáz 75 0,25 1,30 0,42 2,00 4 10 mmól/liter mmól/liter mmól/liter mmól/liter mmól/liter egység/ml egység/ml 1.2 A meghatározás kivitelezése: Hullámhossz: 546 nm. Rétegvastagság: 10 mm. Hőmérséklet: 25°C. Mérés reagensértékkel szemben. A küvettába pipettázni: Minta (M) 1.1 reagens 2,00 ml Minta* 0,10 ml Víz - 0,10 ml összekeverni, 10 percig inkubálni, és utána az M extinkcióját megmérni RV-vel szemben (AE). * i-Metfl-hidantoin 87,7-1754 pmól/liter koncent-Reagensvakérték (RV) 2,00 ml 50 55 60 7.1.2. 1-Metil-hidantoináz (15 egység/ml 50%-os glicerinben, pH 8,0). 7.2 A meghatározás kivitelezése : Hullámhossz: 365 nm. Rétegvastagság: 10 nm. Hőmérséklet: 25°C. Mérés reakcióelegy-vakértékkel szemben. Reakcióelegy vakértékelc (RV) 1,00 ml 0,20 ml egység/ml A küvettába pipettázni: egység/ml 45 Minta egység/mlg/?nl (M) I. reagens 1,00 ml Minta** 0,20 ml Víz 4 percig inkubálni, mérni a minta kiindulási extinkcióját (Ej M) és a reakcióelegy-vakpróba kiindulási extinkcióját (E, rV). Utána hozzákeverendő: NMH-áz 0,01 ml 0,01 ml További 5-10 perc múlva mérni a minta extinkcióját (E2 ,te) és a reakcióelegy-vakérték extinkcióját (EjRV). E - (Ej >i-Ea M) - (Ei ,RV - Ea ,RV)*** ' 87,7 - 877 /rmól/liter koncentrációjú 1-metil-7
