194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
1 194 303 2 tot sztöchiometrikusan nukleozid-difoszfáttá alakít át, a kreatin-mcghatározás az l-metll-hidantoinból keletkezett reakciótennék meghatározása helyett az egyidejűleg keletkezett nukleozid-djfoszfát, tehát különösen az ADP meghatározásán is alapulhat. Az ADP meghatározására Ismeretesek megfelelő eljárások, például H. U. Bergmeyer „Methoden der enzymatischen Analyse,, c. művéből (3. kiadás, 1874. 2128. oldaltól és 2178. oldaltól). Részletezett leírás ezért ezen a helyen felesleges. A találmány szerinti kreatinin meghatározására szolgáló reagens kreatinin-deziminázt, 1-metfl-hidantoínázt, ATP-t vagy GTP-t, kétvegyértékű fémionokat, N-karbamoD-szarkozin-amidohidrolázt, szarkozin-oxidázt vagy szarkozin-dehidrogenázt és pH = 7,0-9,0 közötti pufferanyagot tartalmaz. A reagens tartalmaz ezenkívül előnyösen még hidrogén-peroxid vagy formaldehid meghatározására szolgáló valamilyen rendszert is vagy valamilyen színképző elektronakceptor-rendszert, például valamilyen tetrazóliumsót a szarkozin-dehidrogenáz-reakció közvetlen láthatóvá tételére. Ezek a rendszerek ismertek, például H. U. Jiergmeyer „Methoden der enzimatischen Analyse c. művéből (Verlag Chemie, Weinheim). A reakcióelegy az említett alkotórészek mellett még tartósítószereket, például nátrium-azidot, detergenseket és a trigliceridektől zavaros minták átlátszóvá tételére lipázokat is tartalmazhat, valamint kálium-[hexaciano-ferrát(II)]t és aszkorbát-oxidázt a hidrogén-peroxid kimutatási reakciónak a mintában lévő billirubin vagy aszkorbinsav által okozott zavarásának elkerülésére. A reakcióelegynek csak 1-metil-hidantoin meghatározására való alkalmazása esetén a kreatinin-iminohidroláz el is hagyható. A találmány szerinti reagensek kétértékű fémionokként célszerűen különösen magnézium- vagy mangán-ionokat tartalmaznak, ahogy az előbbiekben már részletesen említettük. Az említett reakciókomponensek porózus hordozóanyagokra impregnálva is előfordulhatnak, és így például lehetővé tehetik kreatinin illetve 1-metilhidantoin kvantitatív vagy kvalitatív meghatározását úgynevezett tesztcsíkokkal. Egy másik előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti reagens kreatinin-deziminázt, 1-metfl-hidantoinázt, ATP-t vagy GTP-t, kétértékű fémionokat, különösen magnézium- vagy mangán-ionokat, ADP vagy GDP meghatározására szolgáló rendszert, és pH 7,0—9,0 közötti pufferanyagot tartalmaz. Pufferanyagként ebben az esetben káliüm-foszfát puffer az előnyös: a pufferanyag, kreatinindezimináz, 1-metü-hidantoináz, ATP, magnéziumvagy mangán(II)-ionok valamint adott esetben ammo iumsók koncentrációjára általában az előbb megadott adatok érvényesek. Az ADP-kimutatás előnyösen a kapcsolt piruvátkináz/laktát-dehidrogenáz rendszer segítségével történik foszfo-enol-piruvát és NADH jelenlétében, amikor a keletkezett ADP-mennyiséget végül a laktátdehidrogenáz-reakcióban fogyó NADH-n át mérjük fotometriásan. Ez az eljárás is ismert a szakember által, és ezért ezen a helyen semmilyen közelebbi részletezése nem Indokolt. A reakcióelegy egyedül l-metll-hidantoin meghatározására való alkalmazása esetében a kreatininimjnphidroláz el is hagyható. A következő példák az ábrákkal együtt részletesebben szemléltetik a találmányt. Az ábrák a következők: 1. ábra: Az 5. példa szerint kapott extinkcióértékek grafikus ábrázolása az l-metil-hidantoin mennyiségének függvényében. 2. ábra: Az 1. ábrához hasonló ábrázolás a 6. példában 1-metil-hidantoin helyett N-karbamofl-szarkozin alkalmazása esetén. 3. ábra: Az 5. és 6. példa eredményeit összehasonlító grafikus ábrázolása. 4. ábra: Az 1. ábrához hasonló grafikus diagram a 7. példa esetében. 5. ábra: A sztöchiometrikus ADP-képződés grafikus ábrázolása. 6. ábra: Az 1. ábrához hasonló grafikus diagram a 8. példa esetében. A leírás során a következő rövidítéseket és szinonim elnevezéseket használjuk: AS: ammónium-szulfát, CSH-áz: N-karbamoil-szarkozin-amidohidroláz, Kreatinin-dezimináz = kreatinin-iminohidroláz, 1-Metfl-hidantoináz, NMH-áz: 1-metil-hldantoinhidroláz, N-Metil-hidantoin, NMH: 1-metil-hidantoln, OD: (optische Dichte) optikai sűrűség, PABS: para-ámino-benzoesav, PPi: pirofoszfát, TES: 2- [trisz(hidroxi-metil)-metfl]-amino -etán szulfonsav, TRIS: ftrisz(hidroxi-meti])-amino]-metán. 1. példa A) A kiindulási törzs tenyésztése. Arthrobacter species DSM 2563-t (amelyet szántóföldből elkülönítettünk el) 3-hetenkénti átoltással a következő összetételű ferde agaron tartunk: Literenként: 7 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, 3 g kálium-dihidrogén-foszfát, 0,5 g nátrium-klorid, 0,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát, 10 g N-metfl-hidantoin (NMH), 1 ml 1. sz. nyomelemoldat, 0,1 ml 2. sz. nyomelemoldat, 1 ml vitaminoldat, 20 g agar, pH 7,5. 1. sz. nyomelemoldat: 100 mg mangán(II)-klorid-tetrahidrát, 100 mg vas(III)-klorid-hexahidrát, 100 mg kalcium(IIl)-klorid-dihldrát, 100 ml kétszer desztillált vízben oldva, és sterilizálva. Az oldat 1 ml-ét adjuk 1 liter táptalajhoz. 2. sz. nyomelemoldat: 1 mg réz(II)-klorid-dihidrát, 1 mg cink(II)-klorid, 1 mg ammónium-[tetraoxo-molibdenát(VI)]. 1 mg Kobalt(H)-klorid-hexahldrát, 1000 mg kétszer desztillált vízben oldva, és sterilizálva. Az oldat 0,1 ml-ét adjuk 1 liter táptalajhoz. Vitaminoldat: 0,1 mg biotin, 0,1 mg piridosamln-hidroklorid, 0,1 mg PABS, 1,0 mg ribotflavin, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
