194302. lajstromszámú szabadalom • Új lemeztáptalaj és eljárás szalmonella speciesek hatékonyabb izolálására
1 194 302 2 szése már nem lehetséges. Ez a megállapítás természetesen a SalmoneOára is vonatkozik. Előkisérleteink folyamán azt tapasztaltuk, hogy briüantzöldet tartalmazó lemeztáptalajon is tenyészik a Salmonella, ha a táptalaj magnézjum-kloridot is tartalmaz legalább 0,5%-os koncentrációban. Ez a találmány tárgyát képező új megfigyelés. Biológia] szempontból ez azt jelenti, hogy a magnézium-klorid „detoxikálja’ a brillantzöld festéket a Salmonella tenyésztése szempontjából a táptalajon. Ez a detoxikáló hatás azonban más bélbaktériumokra nem vonatkozik, tehát ilyen Összetételű táptalajon az egyéb bélbaktériumok nem tenyésznek, csak a Salmonella. A továbbiakban csak a magnézjum-kloridot vizsgáltuk, nevezetesen azt, hogy emelkedő koncentrációkat alkalmazva, milyen a bélbaktériumok tűrőképessége ezzel a kémiai vegyülettel szemben. Megállapítottuk, hogy az emelkedő koncentrációkkal a bélbaktériumokkal szemben bekövetkező gátlás fokozódott, magasabb koncentrációk pedig már a Salmonella növekedését is kezdték gátolni. Ezek után meghatároztuk azt az optimális magnézium koncentrációt, amely az adott brillantzöld festékkel együtt a lemezen a kívánt gátló hatást biztosította az egyéb bélbaktériumokkal szemben. Ilymódon tehát ennek a két komponensnek az együttes használatával sikerül eliminálni a lemezen a nem kívánatos egyéb bélbaktériumok telepeinek a növekedését. A szelektív táptalaj lényegét jelentő fenti két komponens képezi a találmány tárgyát. Tovább finomítható azonban a kimutathatóság az indikátor rendszer megfelelő kiválasztásával. A lemeztáptalajjal kapcsolatban tehát, mivel esetenként nem csak a Salmonella tenyészik rajta, meg kellett oldani az indikátor-rendszerrel való működtetést. Nagy problémát jelent a jelenlévő és erősen zavaró hatású brillantzöld intenzív színe. Találtunk egy olyan festéket, amely megoldja a brillantzöld színével kapcsolatos problémát, egyúttal pedig szerencsésen indikátor céljára is alkalmasnak bizonyul. A neutrálvörös indikátor az alkalmazott koncentrációban és a táptalaj pH-ján szinte teljesen semlegesíti a brillantzöld színét. Ilymódon az inkubálás után a táptalaj eredeti ó-arany színének megtartása mellett a Salmonella telepek sárga színűek lesznek (mivel az alaptáptalaj segítségével lúgos pH-jú anyagcsere termékeket produkálnak). A Salmonella telepek centrumában jelentkező rózsaszín elszíneződés savanyú pH-ra utal, amelynek a kialakulását elősegíti a táptalajban lévő kis mennyiségű glükóz is. Az esetlegesen növekedő egyéb baktériumtelepek a Salmonella telepektől eltérnek és jól elkülöníthetők a telepmorfológiájuk alapján és a színűk alapján is. Ezt a táptalajban lévő szacharóz és a neutrálvörös Indikátor együttesen teszi lehetővé. A legtöbb bélbaktérium bontja a szacharózt (a Salmonella nem bontja), ilymódon ha a táptalajon tenyésznek, ekkor ezekre a baktériumtelepekre az aktuális pH-tól függően a lila vagy piros szín lesz jellemző, illetve különböző színárnyalatok, amelyeket a brillantzöld festék színe is motivál. A Salmonella izoláló lemeztáptalajoknál differenciáló cukorként főleg laktózt használnak, amelyet esetleg egyéb cukorral is kiegészítenek. A mi esetünkben kizárólag szacharózt használtunk differenciáló cukör céljára. Ez azzal az előnnyel jár, hogy amennyi4 ben a Salmonella genuszon belüli Salmonella arizonae specieseket kell izolálni, ez semmilyen nehézséget nem okoz. A laktózt tartalmazó lemezeknél problémák léphetnek fel az izolálásnál, mivel a Salmonella arizonae speciesek mintegy 50%-ban bontják a laktózt, (az egyéb Salmonella genuszok speciesei nem bontják), ilymódon a lemeztáptalajon úgy viselkednek, mint a coli baktériumok, tehát elkallódnak az izolálás szempontjából. A lemeztáptalajra adott szélesztési technikával kell leoltani, ami azt jelenti, hogy szélesztő kaccsal (széklet esetében szélesztő pálcával) egy fentről lefelé irányuló vonalat húzunk a lemez közepén, utána fentről lefelé haladva balról jobbra és viszont a középvonalra merőleges vonalakat húzunk, anélkül, hogy a kacsot leégetnénk. Elárasztásos szélesztést (0,1 ml-t egyenletesen szélesztünk el a lemez felületén) gyakran alkalmazunk az élelmiszer vizsgálatoknál, ez a szélestési típus itt nem alkalmas, ami a lemezek vízaktivitásával függ össze. 1. példa Székletvizsgálat Standard módszer a) Ismert módszer Direkt leoltás A székletmintából közvetlenül leoltást végzünk fémpálcával (vagy üvegbottal) szokásos ritkító szélesztéssel bizmutszulfit-agar lemezre és egy brillantzöld lemezre (OKI lemezek). A lemezeket másnapig 37°C-on inkubáljuk. Dúsítás A lemezekre való leoltás után ugyanazzal a bottal kevés mennyiséget beviszünk kémcsőben levő (OKI- féle) szelenites dúsító táptalajba. A kémcsöveket 37°C-on másnapig inkubáljuk, majd a brillantzöld és bizmutszulfit lemezekre kioltunk belőlük, ezeket a lemezeket 37°C-on másnapig inkubáljuk. A direkt módon leoltott lemezeket a leoltás után 24 óra múlva, a dúsítóból leoltott lemezeket a leoltás után ugyancsak 24 óra múlva, azaz a vizsgálat kezdetétől számított 48 óra múlva megvizsgáljuk Salmonella-gyanús baktérium telepek jelenlétére. Ha ilyeneket találunk, akkor ezekből tovább oltunk biokémiai és szerológiai azonosítás céljából. Az ismert lemezekkel végzett vizsgálatoknál Salmonella pozitív székletek esetében csak alacsony százalékban (10% alatt) kapunk a direkt leoltással pozitivitást. A pozitív minták nagy része csak a dúsítás utáni leoltásból adódik. b) Találmány szerinti megoldás Ugyanazt az eljárást hajtjuk végre, mint az előzőekben, de a találmány szerinti lemezre oltunk le. A Salmonella pozitív székletek esetében már a direkt leoltás után az çsetek több mint 50%-ában pozitív eredményt kapunk. 2. példa Élelmiszervizsgálat a) Ismert módszer A vizsgálatot a Salmoneüának élelmiszerekből való kimutatására vonatkozó NSz 3640-8/80. sz. szabvány figyelembevételével végezzük. Direkt leoltás Erre csak ételmérgezés gyanúja esetén kerül sor. A találmány szerinti módszerrel ilyenkor sok esetben már 24 óra múlva mutatkoznak gyanús telepek, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
