194284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és in-vitro reagens-készlet glikokólsav meghatározására
1 194.284 2 amino-propil) -karbodiimidet HCl-t 50 jul piridin-viz 1:1 elegyében, majd 5,8 mg(lOpmól) 3a-(3-karboxtpropionil)-glikokólsav-metil-észtert 100 pl piridinben oldottunk. A reakdóelegy az epesavderivátum triciált-származékát (0,01 pCl) is tartalmazta. Az oldatokat egyesítettük, a pH-t 6,0—6,3-ra állítottuk, majd az elegyet 72 órán át szobahőmérsékleten kevertettük. Ezután az oldatot 400 pl 0,1 mól/1 (pH = 74,) foszfátpufferrel hígítottuk és 800 pl butanollal extraháltuk. A konjugátum Rf 0,46 értéknél jelent meg etil-acetát -metanol-piridin = 55:35:10 elegy ben vékony rétegkromatogramon. Az aktívitásmérések alapján a butanolos oldat konjugát koncentrációja 2400 nmól/ml-nek adódott. b) Jelzés125I-dal és a jlezett anyag tisztítása: Jelzőedénybe a fenti konjugát 1 pl butanolos oldatát mértük és nitrogénáramban bepároltuk, majd 10 pl 0,5 mól/1 foszfátpufferrel (pH = 7,5) ismét oldatba vittük, ezt követően 37 MBq (1 inCi) Na12?I-ot, 20 pg klóramin-T 10 pl-es 0,05 mól/1 foszfátpufferes oldatát adtuk hozzá. A reakcióelegyet 30 másodpercig kevertettük, majd 40 pg nátrium-metabiszulfit 10 ples és 20 pg kálium-jodid 10 pl-es pufferes oldatával elegyítettük. Pufferrel 200 pl-re hígítottuk és 0,5 ml butanollal extraháltuk. A butanolos fázist bepároltuk és a maradékot 100 pl metanolban oldva vékonyrétegre vittük fel. Futtatóelegyként először etil-acetát-metanol-piridin .# 58:37:5 elegyét használtuk, majd az anyagot a 2. példánál leírtak szerint tisztítottuk. A vizsgálatokhoz 40 000 cpm/0,1 ml aktivitású metanolos aJiquotokaí használtunk. 4. példa Reagens-készlet: Glikokólsav meghatározására alkalmas 100 csőből álló készlet az alábbi a)—f) komponenseket tartalmazza: a) Tracer: 20 ml 3o-(3-karboxi-propionil) -glikokólsav-metil-észer-12 s I-hisztamin konjugát PBS-oldatban (e). A tracer oldat aktivitása max. 0,25 pCi/ml. b) Glikokólsav antiszérum: a találmány szerinti eljárással termelt nyúl antiszérum liofilizálva, melynek ujraoldásához az e) PBS-oldatot használunk (20 ml). c) Glikokólsav standarok: 0-0,50-1,5-5,0-15,0- 50,0 pmól/1 glikokólsav koncentrációjú oldatok liofilizálva, melyeket pufferoldatban (6x0,5 ml) űjraoldunk. d) Kontroll szérum minták: ismert alacsony (0,5—1,5 pmól/1) és magas koncentrációjú (15,0—50,0 pmól/1) glikokólsav szérumok liofilizálva, melyek ujraoldásához desztillált vizet (2x0,5 ml) használunk. e) PBS-oldat (pH = 7,4), amely 0,2% marha gammaglobulint, 0,3% BSA-t és 0,1% nátrium-azidot tartalmaz, térfogata 50 ml. f) Reagens-oldat a szabadás kötött frakció szétválasztására : polietilén-glikol 6000, 30%-os vizes oldat, térfogata 60 ml, amely nárium-kloridot és 0,1% nátriumazidot tartalmaz. 1 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a (II) általános képletű - ahol X-NH- 5 jelentése az i mmun ogének előá llítására alkalmas fehérjemaradék - új immunogén előállítására, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű haptén 70—120 mólnyi mennyiségét kapcsoljuk a peptidkémiában ismert módon 1 mól X—NH2 képletű fehéijéhez, miközben a reakdóelegy pH-ját 8,3 és 8,5 között tartjuk. 10 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j elleni e z v e, hogy X—NH2 képletű fehérjeként marha szérum albumint (BSA) alkalmazunk. 3. Eljárás nagy specificitású antiszérum termelésére melegvérű állatok — előnyösen nyúl — immunizálása és az antiszérum elkülönítése útján, azzal j e i 1 e -10 m e z v e, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (II) általános képletű immunogénnel immunizálunk, majd az antiszérumot ismert módon kinyerjük. 4. Eljárás 12 51-dal jelzett új tracer előállítására, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű haptén sza-20 bad karboxil-csoportja és valamely radioaktív jelzésre alkalmas aminosav vagy amin szabad amino-csoportja között a peptidkémiában szokásos módon peptídkötést hozunk létre és az aminosavat vagy amint a kapcsolás előtt vagy után 12 51-dal jelezzük. 5. A 4. igénypont szerint eljárás, azzal j e 1 1 e - 25 m e z v e, hogy aminként hisztamint alkalmazunk. 6. Reagens-készlet glikokólsav meghatározására biológiai folyadékmintákban — előnyösen vérszérumban — radioimmun-módszer útján, amelyre jellemző, hogy komponensként a) az 5. igénypont szerinti eljárással előállított max. 30 0,25 pCi/ml aktivitású tracert pH = 7,4-t biztosító puffer-oldatban, b) a 3. igénypont szerinti eljárással előállított antiszérumot liofiíizált állapotban, amely 5—50 ezerszeres véghígításban alkalmazható, »e c) a meghatározandó epesav standard oldatait liofilizált állapotban, d) a meghatározandó epesavat ismert koncentrációban tartalmazó kontroll szérum-mintákat, e) a b) összetevő ujraoldásához, valamint a vizsgálandó szárum-minták hígításához 7,4 pH-jú foszfát-puf-40 fer-oldatot, f) a szabad és kötött frakciót szétválasztó polieiilénglikol reagens-oldatot tartalmazza. 7. A 6. igénypont szerinti reagens-készlet glikokólsav meghatározására vérszérumban, azzal je 11 e -45 m e z v e, hogy a) 3a-(3-karboxi-propionil) -glikokólsav-me til-észter- 1 5 í-hisztamin konjugátot 0,2% marha gammaglobulint, 0,3% BSA-t és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-oldatban, __ b) liofiíizált nyúl antiszérumot, c) 0; 0,50; 1,5; 5,0; 15,0; 50,0 pmlól/1 koncentrációjú liofiíizált glikokólsav standard oldatokat, d) ismert alacsony (0,5—1,5) pmól/1 és magas (15,0— 50,0) pmól/1 koncentrációjú liofiíizált glikokólsav szérum mintákat, gc e) PBS-oldatot (pH = 7,4),amely 0 ,2% marha gammaglobuline 03% BSA-t és 0,1% nátrium-aridot tartalmaz, a b) komponens oldására, valamint a vizsgálandó szérum-minták hígítására, f) polietiléng-likol reagens 30%-os vizes oldatát, amely nátrium-klorid és 0,1% nátriumazid tartalmú, 60 tartalmaz. 1 db rajz 6
