194261. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új N-szubsztituált neuraminsav-származékok előállítására
1 2 A találmány kiváló immunológiai hatású új, N-szubsztituált neuraminsav-származékok előállítására vonatkozik. Az irodalomból ismert, hogy nagyon sok általában és néhány baktériumsejtfelületén találhatók N-szubsztituált neuraminsavak szialinsawal képezett komplex, így glíkoprotein, glikolipid, oligoszacharid vagy poliszacharid formájában. Újabban az N-szubsztituált neuraminsavak fontos anyagokká váltak a gyógyászatban és az idegműködéssel, rákkal, gyulladással, immunitássá, vírusos fertőzéssel, differenciálással, hormon receptorral stb. kapcsolatos gyógyszerek területén. Azonban a szialínsav komplexben lévő N-szubsztituált neuraminsavak szerepét még nem határozták meg. Sok szerves kémikus tanulmányozta az N-szubsztituált neuraminsavakat, és ezért ezeknek sok egyszerű származékát állították elő. Ezideig azonban kiváló immunológiai hatású származékot nem találtak közöttük. Az emberi élet átlagos hosszát megnövelte a vérképző szervek rosszindulatú daganatainak, sokfajta ráknak és kollagén betegségnek a gyógykezelésében bekövetkezett fejlődés. Ugyanakkor a gyógyszerek, például a mellékvesekéreg hormon vagy immunoszupresszáns alkalmazásának nagymértékű növekedése miatt számos nem kívánatos mellékhatás jelentkezett az immunológiai kompetencia csökkenésével együtt. Ilyen körülmények között különös figyelmet fordítottunk a szialinsavra, amely egy biológiailag elidegeníthetetlen összetevő, és kísérleteket folytattunk olyan, az immunitás szabályozására alkalmas szerek területén, amelyeknek a kémiai változtatás következtében csak néhány mellékhatásuk van, ugyanakkor szabályozzák az immunológiai ellenőrzést. A kutatás vegyületeket, amelyek immunszabályozó hatást mutatnak oly módon, hogy az elfojtó T sejtet aktiválják, és a B sejt immunglobulin termelését visszaszorítják. A találmány célja olyan új vegyületek előállítása, amelyek kiváló immunológiai, különösen immunszabályozó hatásúak. A találmány szerint az új, N-szubsztituált neuraminsav-származékok az I általános képlettel jellemezhetők, amelyben R1 hidrogén tatom vagy acetilcsoport, és A -NH-CHR2-CO- általános képletű aminosav-maradék, amelynek karbonilcsoportja i az I általános képletnek megfelelően az -NH-csoporthoz, és nitrogénatomja a benziloxi-karbonil-csoporthoz kapcsolódik, és R* hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 1-4 szénatomos hidroxi-alkilcsoport, 1-6 szénatomos tioalkil-csoport vagy fenil(í -4 szénatomos)-alkil-csoport, A találmány szerinti olyan I általános képletű vegyúieteket, amelyekben R1 jelnetése hidrogénatom, az [A] reakcióvázlaton bemutatott eljárással állíthatjuk elő, A II képletű neuraminsav és a III általános képletű N-(benzil-oxo-karboniI)-amínsav-származékok kapcsolására ismertek módszerek, amelyek szerint a vegyületeket először aktív származékaikká alakítják és aztán kapcsolák. Ezek azok a módszerek, amelyekben az N-terminálist és C-terminálist aktiválják (ezek a savkloridot, savazidot, vegyesanhidridet vagy aktív észtert alalkalmazó eljárások). Az aktiválás egy konkrét példája, amikor a II képletfi és III általános képletű vegyületek elegyéhez <&ciklohexil-karbodiimidet adnak. Oldószerként metilén-kloridot, acetonitrilt, dimetil-formamidot, piridint vagy tetrahidrofuránt alkalmazhatunk. A kapcsolási reakció során fellépő racém-módosulat képződés visszaszorítására alkalmas általános eljárásként az egy edényes módszer ismert, amely szerint diciklohexil-karbodiímidet és egy N-hidroxi-vegyületet alkalmazunk karboxil-csoport-aktiváló reagensként. Ilyen N-hidroxi-vegyületek az N-hidroxi-szukcinimid, 1-hidroxi-benzotriazol, 3-hidroxi-4-oxo-3,4- -dihidro-l,2,3-benzotriazin és N-hidroxl-5-norbornén-2,3-dikarboximid. A reakcióhoz’oldószerként tetrahidrofuránt és dimetil-formamidot használhatunk. Az előbb említett N-hidroxi-vegyület és oldószer előnyös kombinációja a dimetil-formamid és az N- hidroxi-5-norbomén-2,3-dikarboxímid. Az Rl helyén acetilcsoportot tartalmazó I általános képletű vegyületeket egy IV általános képletű vegyület és ecetsavanhidrid vízmentes piridinben való reakciójával állíthatjuk elő. A II képletű vegyület hidroklorid addiciós sójának előállítását a J.A.C.S. 99,8273/1977/ irodalmi helyen írták el. A találmány szerint az I általános képletű vegyületek kiválóan alkalmasak az immunrendszer ellenállóképességének fokozására. Az immunrendszer erősítésére való képességüket a következő módszerrel igazolhatjuk. Egérlép limfocita ConA-val való aktiválása elleni hatás vizsgálata Mivel egy T sejt nem-specifikusan aktíváit Con A-val, egy találmány szerinti N-szubsztituált neuraminsav-származékot adtunk a szervezethez és a hatását vizsgáltuk. Nevezetesen Con A-val és egy I általános képletű vegyületet, amelyet például a későbbiekben bemutatott példák szerint állítottunk elő, adtunk BALB/C egerekből izolált lép límfocitához (SPC, spleen lmyphocyte) és az elegy et kb. 20 órán át fermentáltuk egy mikrolemezen 5% COj hozzáadásával, 37 °C-on. Triciummal jelzett timidint és SPC-t az elegyből elkülönítettünk körülbelül 10 órás tenyésztés után. Az SPC által felvett 3H-timidin mennyiségét szcintillációs számlálóval határozok meg. Egy IV általános képletű vegyülethez viszonyítva egy I általános képletű vegyület elősegítette és megerősítette a 3H-timidin felvételt, és a T sejt Con A-val való aktiválása elleni hatás is javult. Az egérlép limfocita immunoglobulin termelése elleni hatás vizsgálata Azoknak az N-helyettesített neuraminsav-száimazékoknak, amelyekre az előző kísérletben a T sejt aktiválásával kapcsolatban utaltunk, az immunoglobulin termelés elleni hatását is tanulmányoztuk a vérlemezke képző sejtek (PFC, plaque formín cells) számának mérésével. Először bárány vörösvérsejtet és egy I általános képletű (például a későbbiekben bemutatott példa szerint előállított) vegyületet adtunk az SPC-hez, és az eiegyet 37 °C-on tartottuk 5 napig. Az így kapott érzékenyített SPC-hez SRBC-t és jelzőanyagot adtunk. Miután az említett eiegyet Cunningham kamrában 37 °C-on 3 és 12 óra közötti időtartamig tenyésztettük, a PFC-t megszámoltuk. Mivel a PFC számában csökkenést figyeltünk meg, és a sejt életképessége a kontroliéval azonos volt, azt 194.261 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
