194225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-oxo-11H-pirido [2,1-b]kinazolin-karbonsav-származékok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 225 2 k) Vérlemezke aktívdió faktor (PAF) által előidézett pusztulás megelőzése 20-30 g súlyú hímegerek ad libitum kapnak táplálékot. Racém 2- t[(2<acetoxi>3<oktadeciloxi> -propoxi)hidroxi-foszfinil]-oxl ) -N,N,N-trimetil-etán-aminium-hidroxid belső só hemihidrátot (PAF) etanolban betöményítünk (koncentráció 1 mg/ml). A kísérlet időpontjában a PAF-t 0,1%-os marhaszérumalbuminban hígítjuk és 10 egérnek 0,10 mg/kg intravénás dózisban beadjuk, egy órával a teszt-vegyület vagy hordozóanyag (marhaszérumalbumin) beadagolása után. A PAF-el kezelt egerek 30 perccel az i. v. befecskendezése után elpusztulnak. A PAF-el kezelt egerek mortalitása legalább 80%. A 2-(l-metil-etil)-N-[6-(3-piridil)-hexil]-l 1-oxo-1 lH-pirido[2,l-b]kinazolin-8-karboxamid meggátolja a PAF által előidézett pusztulást. A számított orális IDjo érték (gátló dózis) 13 mg/kg. A 2-( 1 -metil-etil)-N-[6-( 1 H-imidazol-1 -il)-hexil]-l 1- -oxo-1 lH-pirido[2,l-b]kinazolin-8-karboxamid orális IDjo értéke 17 mg/kg. 1 ) Vérlemezkeaggregáció in vitro gátlása A Bőm G. V. R. által leírt [Nature, 194, 927 (1962)] turbidometriás módszert alkalmazzuk. Vérlemezkékben dus plazmát (PRP) és vérlemezkékben szegény plazmát (PPP) készítünk 0,38% nátrium-10 15 20 25-citráttal kezelt vérrel. A centrifugálás sebessége és időtartama az egyes fajoktól függően változik; így emberek 160 g 20 percen át; kutyán 160 g 15 percen keresztül; tengerimalacori és nyálon 160 g 15 percen át és patkányon 230 g 10 percen keresztül. Az aggregációt Payton kettős lánc modul vagy Chronolog lumiaggregometer segítségével követjük nyomon és az ATP felszabadulást egyidejűleg mérjük. A küvettához 0,45 ml PRP-t adunk és 37°C-ra előmelegítjük. A stimulálószert (arachidonsav vagy szintetikus vérlemezke aktiváló faktor) 50 - pl térfogatban adjuk hozzá; az összes többi ágenst 5 pl térfogatban adagoljuk. A teszt-vegyületet nem tartalmazó mintákhoz hordozóanyagot adunk. A PRP-re és PPP-re 0 illetve 100%-os fényáteresztési értékeket veszünk fel. Az aggregáció %-ot 5 perccel az aggregációs ágens hozzáadása után a fényáteresztés %-os növekedéséből számítjuk ki. Az aggregációgátlás céljából előbb az inhibitort adjuk hozzá, ezután a vérlemezkékkel 1 percen át keverés közben előinkubáljuk, majd hozzáadjuk a stimulátort. A százalékos gátlást a teszt-vegyülettel és anélkül mért %-os aggregációs értékekből számítjuk ki az alábbi képlet segítségével: teszt-vegyülettel mért %-os gátlás = l-t_.__ aggregáció — — x 100 hordozóanyaggal mért %-os aggregáció A fenti tesztekben kapott eredményeket a III. Táblázatban tüntetjük fel. III. Táblázat Arachidonsav és vérlemezke aktiváló faktoJ1 ^ által előidézett vérlemezkeaggregáció gátlása (Ic) általános képle tű teszt-vegyületek R X n Hét AA^ PAFf 21 (ch3)2ch NH 4 3-piridil ■f + HO NH 4 3-piridil + + ch3 NH 4 3-piridil + ___ (CH3)2CH-0 NH 4 3-piridil + + (CH3)2CH NH 6 3-píridil + 4-(CH3)2CH NH 5 4-piridil — + (CHrCH3)2CH-O-3 3-piridil — ♦ (ch3)2ch NH 2 4-tio-piridil + + (ch3)2ch NH 4 1-imidazolil + ___ (CH3)2CH NH 5 1-imidazolil ■f — m) Vérlemezke aktiváló faktor (PAF) radioreceptor 50 megkötési teszt Citráttal kezelt kutyavérből centrifugálással vérlemezkékben dús plazmát készítünk. A pH-t 0,15 mólos citromsavval történő savanyítással 6,5 értékre állítjuk be és 10 percen át 1000 g sebességgel centrifugáljuk. A kapott pelletirozott vérlemezké- 55 két EDTA-foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldatban (PBS) történő újraszuszpendálással mossuk és újracantrifugáljuk. A mosott vérlemezke készítményt 0,1%-os BSAPBS-ben 2x10? ^rlemezke/50 pl koncentrációra „ állítjuk be. 60 50 pl szilikon-olajat (fajsúly 1,023) tartalmazó 400 literes mikrofuga-csőbe puffert, PAF standardot vagy analógot vagy extraktumot adunk és a vizes rész térfogatát 150 pl-re töltjük fel. Ezután 50 pl *H-PAF-t (10.000 cpm, 45 Ci(millimól), majd 2xl07 kutyavérlemezkét adunk hozzá. Keverés, szobahőmérsékleten 10 percen át történő inkubálás, majd 1 perces centrifugálás (8000 g) után a vérlemezkéket a cső végének levágása útján eltávolítjuk, a vérlemezkéket 200 pl 50%-os metanollal szolubilizáljuk és 10 ml Aquasolban megszámláljuk. 10 per-» ces inkubációs periódus alatt 50-2500 pg/cső görbét kapunk, ami nagyfokú specifikusságra és a PAF-el 10
