193911. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas biológiai aktivitású antimicin-a komplex előállítására
193911 metános fázist elválasztjuk. A felső vizes fázist elöntjük. A kiextrahált száraz micéliumot hasonló körülmények között további 200 1 diklórmetánnal extraháljuk, és ezt az extraktumot egyesítjük az előbbiekben elválasztott 5 alsó fázissal. A diklórmetános kivonatokat nátriumszulfáton megszárítjuk, majd vákuumban, maximum 40 °C-on, szárazra pároljuk. A párlási maradék sötétbarna zsírszerű massza, melyet 50 1 ligroinnal elkeverünk és 10 az elegyet leszűrjük. 11,2 kg barna színű anyagot kapunk, melynek antimicin tartalma 650 pg/mg. Ezt az anyagot melegen feloldjuk 80 liter diklórmetánban, az oldatot megszűrjük és a szűrlethez 400 liter metanolt 15 adunk. Az elegyet 0 °C-ra lehűtjük, és 24 órás állás után a kivált csapadékot kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban 40 °C-on szárazra pároljuk. A párlási maradékhoz 8 liter ligroint adunk, az elegyet jól elkeverjük, majd 20 megszűrjük. 6,6 kg, 840 pg/mg hatékonyságú nyers antimicin-A komplexet kapunk. c.) Kristályos antimicin-A komplex előállítása 25 Az előző pont szerint kapott nyers antimicin-A komplexből 50 g-ot melegítés közben feloldunk 550 ml diklórmetán-hexán 1 : 3 elegyében, majd az elegyet megszűrjük. A szűrletet egy 8,5 cm átmérőjű kromatogra- 30 fáló oszlopban lévő 100 cm rétegmagasságú szilikagél (Kieselgel 0,2-0,5 mm /Merck/) tetejére rétegezzük. (A szilikagélt előzőleg diklórmetán-hexán 1 : 4 elegyével töltjük be az oszlopba). Az anyagot 1000 ml diklór- 35 metán-hexán 1 : 4 eleggyel bemossuk, majd sorrendben 10-10 liternyi 1:4, 1:1, 2:1, 4 : 1 arányú diklórmetán-hexán elegyekkel, végül 20 liter tiszta diklórmetánnal oldjuk le az antimicin-A komplexet. A leoldás se- 40 bessége 2,50 1 /óra. 3 literes frakciókat szedünk és a frakciókból biológiai értékméréssel (Saccharomyces cerevisiae) ellenőrizzük az antimicin tartalmat. Az antimicint tartalmazó 18-23. frakciókat egyesítjük, és váku- 45 umban szárazra pároljuk. 40,5 g tisztított antimicint kapunk (955 pg/mg). A fenti 40,5 g antimicint melegítés közben feloldjuk 500 ml benzolban, 2 g aktív szenet és 5 g Hyflo-supercelt adunk hozzá, majd melegen leszűr- 50 jük. A szűrlethez 2800 ml meleg hexánt adunk, majd az elegyet lassan hagyjuk lehűlni. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után az elegyet 24 órára hűtőszekrénybe tesszük és a kivált kristályos antimicint leszűrjük, hexán- 55 na! átmossuk, majd vákuumban megszárítjuk. Ily módon 31,2 g tiszta, kristályos antimicin-A komplexet kapunk. A termék tulajdonságai a következők: op.: 167-168 °C, 60 [a]£°=81,l 0 (1 %, kloroform), kmai=226, 313 mp (metanol): 224, 342 mp (metanok-5 0,1 n NaOH); Elem-analízis: C=60,23 %; H=7,36 %; N=5,45 %; Hamu=0. A HPLC-vizsgálatok szerint (t.of Chrom. 234, 187-200, 1982) az így kapott termék öszszetétele a követkéző: A! komponens: < 1% (nyomokban) A2 — < 1 % — A3 —„— 54%—».— A4— 41 % —»»— A5—M— ~ 2%— »— Ag—>»— ~ 2%. h Az 1. példa szerinti terméket összehasonlítva a standard antimicin-A komplexszel (SERVA) az alábbi módszerekkel vizsgáltuk: A.) Kvalitatív vizsgálatok: Módszer: A vizsgálatokat bioautográfiával kombinált vékonyrétegkromatográfiás (szilikagél G, 500 p) módszerrel végeztük. Az alkalmazott futtatóelegy metanol-kloroform 15 : 185 arányú elegye, indikátormikroorganizmus Aspergillus niger volt. Eredmények: A két vizsgált anyag R,- értékei a fenti rendszerben gyakorlatilag azonosnak bizonyultak (standard: 0,78 ± 0,00; termék: 0,78 ± 0,02). A módszer érzékenységének figyelembevételével megállapítható volt, hogy a termék a standard antimicin-A komplextől eltérő R/ értékkel futó biológiailag aktív anyagot nem, vagy csak 0,1 %-nál kisebb mennyiségben tartalmaz. 6 B.) Kvantitatív vizsgálatok: Módszer: A vizsgálatokat agardiffúziós módszerrel, Aspergillus niger törzs (indikátor) felhasználásával 8 párhuzamos méréssel végeztük. Eredmények: A mért adatok alapján számított regressziós egyenesek korrelációs koefficiensei igen szorosak, a két .egyenes meredeksége közel azonos. A négy mérési pontban végzett összehasonlítás alapján az 1. példa szerinti termék aktivitása 116,4 ± 2,2 %-a a standard antimicin-A komplexnek. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás antimicin-A komplex előállítására fermentációs úton, azzal jellemezve, hogy a Streptoverticillium hiroshimense sugárgomba faj MNG 00286 számon letétbe helyezett törzsét, vagy annak valamely antimicin-A komplexet termelő mutánsát vagy variánsát, fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó táptalajon, aerob körülmények között, 20-40 °C-on, legalább 50 órán át tenyésztjük, és az így kapott tenyészetből az antimicin-A komplexet kívánt esetben ismert módon elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 26-32 °C-on 70-100 órán át végezzük. Rajz nélkül 4
