193905. lajstromszámú szabadalom • Glikopeptid antibiotikumok előállítása biokonverzió útján
193905 missouriensis CSV 558 konvertáló tenyészet növekedő kultúrájához. A biokonverziót TLC- vel követjük. Amikor a biokonverzió teljes, a fermentlevet szűréssel szeparáljuk. Az elválasztott micéliumokat vízzel extraháljuk pH 10,5-nél (NaOH-dal beállítva). E kivonatot HP-20 gyantával (185 ml) töltött oszlopon az 1. példában leírtak szerint tisztítva liofilizált terméket kapunk. E termék egy részét (160 mg) 170 ml Fractogel TSK HW-40S gyantával (32-63 p, E. Merck, Darmstadt, NSZK) töltött üvegoszlopra visszük fel, eluensként 3,3 liter vizet, majd 700 ml CH3OH/H20 (1:1) elegyet alkalmazva 3 ml/min átfolyási sebességgel. A termék a CH30H/H20 frakcióban jelenik meg; e frakciót bepároljuk és liofilizáljuk, majd egy hasonlóan előállított termékkel egyesítjük. Az egyesített terméket a fenti gyantán ujrakromatografáljuk a következő lépcsős gradienst használva: CH3OH/ H20 gradiens (1:3) —150 ml; (2:3)—350 ml; (3:2) — 550 ml; és (4:1) —470 ml. A frakciókat analitikai HPLC-vel ellenőrizzük és a kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítve, bepárolva és liofiiizálva 20,3 g A 4696 B2 biokonverziós terméket kapunk. UV-abszorpciós spektrum: kmax 278 nm, sav (e~15000) kmax 355 nm, bázis (e-45000). Oldhatóság: jól oldódik dímetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, acetonitril-víz és alkohol-víz elegyekben. HPLC: megegyezik az 5. példa termékével, azonban a reakciós idő 10,4 perc. 5. példa A 4696 C[a konverziós termék (le vegyület) Az 1. példában leírt eljárást alkalmazva aktaplanin Cm-faktort (240 mg) adunk az A. missouriensis NRRL 15646 konvertáló tenyészet növekedő kultúrájához. Teljes biokonverzió után a fermentlevet leszűrjük és.az elválasztott micéliumokat vízzel extraháljuk pH 10,5-nél (NaOH-dal beállítva). E kivonatot (650 ml) 100 ml HP-20 gyantával töltött oszlopon tisztítjuk az 1. példában leírtak szerint; így 187 mg liofilizált terméket kapunk. E termék ( 185 mg)J3 ml CH30H/H20 (7:3) elegyben oldjuk, átszűrjük és Fractogel TSK HW-40S gyantával töltött 170 ml-es oszlopra visszük fel. Tömegspektrometria (gyors atombombázás): mólsúly 1805. HPLC: oszlop: 4,6x250 mm rozsdamentes acél. töltet: Shandon ODS Hypersil - 5 p. oldószer: CH3CN: 0,5 M (KH2P04; 21: :79), pH 3,2-re állítva H3P04' -gyei. térfogatsebesség: 1,0 ml/perc. detektálás: 220 nm (UV). frontsebesség: 20 cm/óra. 9 retenciós idő: 11,4 perc (CUC/CSV esetén 5,9). Az oszlopot CHjOH/HjO (2:3) eleggyel elualjuk 2 ml/min átfolyási sebesség mellett. A frakciókat B. subtilis-szel beoltott agarlemezeken papírkorongos módszerrel és analitikai HPLC-vel ellenőrizzük. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és Lichroprep RP 8 gyantával (25-40 p) töltött 300 ml-es oszlo.pra visszük fel,CH3CN,/0,05% vizes pirOAc (1:4 pH 3,5 re beállítva) eleggyel eluálva. A frakciókat analitikai HPLC-vel egyesítjük, pH 6,5-re állítjuk be és bepároljuk. E vizes oldatot 60 ml HP-20 gyantával töltött oszlopra visszük fel, és az oszlopot vízzel mossuk a só eltávolítása céljából. Az aktív anyagot CH3CN/H20 (4:1) eleggyel eiuálva és az eluátumot bepárolva és liofiiizálva 5,9 mg A 4696 C\a konverziós terméket kapunk. UV-abszorpciós spektrum (metanol): 278 nm, sav (e~ 15000) hmax 355 nm, bázis (e~15000). Számított móltömeg: 1200. Végabszorpció 230 nm-nél. O dhatóság: jól oldódik dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, acetonitríl-víz és alkohol-víz elegyekben. HPLC: oszlop: 4,6 x 250 mm rozsdamentes acél. töltet: Shandon ODS Hypersil — 5 p. oldószer: CH3CN: 5 M KH2P04 (21:79), pH 3,2-re állítva H3P04- gyel. térfogatsebesség: 1,0 ml/perc. detektálás: 220 mm (UV). frontsebesség: 20 cm/óra. retenciós idő: 13,2 perc (CUC/ /CSV esetén 5,9). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R, mannozil-glükozib, ramnozil-glükozilvagy glükozilcsoport, R2 mannozilcsoport, R3 hidrogénatom vagy mannozilcsoport és R L-risztozaminilcsoport, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű aktaplanin faktor — ahol R, R,( R2 és R3 a fenti »-s Actinoplanes missouriensis NRRL 15646 vagy NRRL 15647 süllyesztett, levegőztetett tenyészetével fermentálunk, célszerűen asszimilálható szén- és nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajban. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyület előállítására, ahol R, mannozil-glükoziicsoport, R2 és R3 mannozicilcsoport és R L-risztozaminilcsoport, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol R, R,, R2 és R3 a fenti. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyület előállítására, ahol 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
