193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
193902 tétünk lassan 30°C hőmérsékleten 4 órán át. A keletkezett L-szerint és piroszőlősavat a szakterületen jól ismert módszerek bármelyikével tisztíthatjuk. 11. példa L-metionin előállítása Egy olyan oldatot, amely 2,5 mmól/liter MgCl2-t, 100 mmól/liter 2-oxo-4-tio-metil-butánsavat, 100 mmól/liter L-aszparaginsavat, 1,0 mg/ml transzaminázt, 1,0 mg/ml oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, és amelynek pH-ja NaOH-val 7,0-ra van beállítva, kevertetünk lassan 30°C hőmérsékleten 4 órán át. A keletkezett L-metionint és piroszőlősavat a szakterületen jól ismert módszerek bármelyikével tisztíthatjuk. 12. példa L-4-fenil-2-amino-butánsav előállítása E.coli K—12 eredetű transzaminázzal Etil 4-fenil-2-oxobutánsav-észtert (Chemical Dinamics) 206 mg, 1 mmól/szuszpendálunk 10 milliliter 0,1 mól/literes NaOH oldatban, és a keveréket 30 percen át kevertetjük, amíg a pH 8,6.alá nem esik, jelezve az etil-észter teljes hidrolízisét. A keveréket rövid ideig centrifugáljuk, és a színtelen felülúszót, amely 4-íenil-2-oxo-butánsav nátriumsót tartalmaz, dekantáljuk. A következő összetételű reakció-oldatot állítjuk elő: 0,700 ml 50 mmól/literes kálium-foszfát puffer, 0,10 ml fentebb előállított 4-fenil-2-oxo-butánsav sóoldat, 0,050 ml 500 mmól/literes dinátrium-L-aszpartátoldat, 1,0 nemzetközi egység almasav dehidrogenáz, 0,1 nemzetközi egység E. coli K—12-ből tisztított aszparaginsav transzamináz, 0,1 mikromól redukált állapotú piridoxál-foszfát (Sigma). A csökkenés az oldat abszorbciójában 360 nm-nél jelzi a reakció menetét. Ez a változás nem figyelhető meg a kontroll kísérletekben, amelyekben a transzamináz, almasav dehidrogenáz, L-aszpartát, vagy 4-fenil-2-oxo-butánsav-só valamelyikét elhagyjuk. A reakció sebessége kb. 16—18%-a annak a reakciónak, amely a 4-fenil-2-oxobutánsav só helyett fenil-piruváttal megy végbe. 13. példa L-4-fenil-2-aminobutánsav előállítása immobilizált enzimekkel Az E. coli K—12-ből származó transzaminázt és Pseudomonas putida ATCC 950-bqJ származó dekarboxilázt immobilizáljuk szukcinil-amino-propil pórusos üvegen (Corning) kovalens kötésekkel, a Weetall által leírt karbpdiimides módszerrel. Az imrnobilizált enzimet egy üvegoszlopba tápláljuk. Egy olyan oldatot, amely 18 g/liter 2-keto-4-fenil-butánsavat, 15 g/liter L-aszparaginsavat, 0,05 g/liter piridoxálfoszfátot, 2,03 g/liter MgCl2.6H20-t tartalmaz, és amelynek pH-ja .50 mmól/literes foszfát-pufferral 7,1-re van beállítva, szivattyúzunk át az oszlopon, és az 11 elfolyó folyadékot frakciókba gyűjtjük. Az átalakulás mértékét a piroszőlősav meghatározásával figyeljük, laktát dehidrogénázt alkalmazva. Az L-4-fenil-2-amino-butánsav és piroszőlősav termékeket ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, tiszta L-4-fenil-2-amino-butánsavat ( [a]£° = —47°) és piroszőlősavat nyerve. 12 SZABADALMI IGÉNYPONTOK L) Eljárás R — CH — COOH I nh2 általános képletü alfa-aminosavak előállítására — ahol R jelentése adott esetben fenil-, hidroxi-fenil-, indolil-, hidroxil- vagy (1—4 szénatomos alkil)-tio-csoporttal helyettesített 1—6 szénatomos egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport —, azzal jellemezve, hogy egy, a fenti aminosavaknak megfelelő alfa-ketosavat L-aszparaginsavval reagáltatunk transzamináz jelenlétében, így alfa-aminosavat és oxálacetátot kapunk, majd az oxálacetátot enzimesen dekarboxilezzük. (Elsőbbsége: 1983.09.0L) 2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzamináz enzimként tisztított vagy részben tisztított enzim készítményt, vagy a transzaminázt tartalmazó teljes sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983.09.01.) 3. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxálacetát dekarboxilezési lépését oxálacetát dekarboxiláz enzimet alkalmazva hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1983.09.01 ) 4. ) A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oxálacetát dekarboxiláz enzimként tisztított vagy részben tisztított enzimkészítményt, vagy az oxálacetát dekarboxilázt tartalmazó teljes sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983.09.01.) 5. ) Az 1—3 igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a transzamináz, mind az oxálacetát dekarboxiláz enzimeket oldhatatlan anyagon rögzített formában alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1983.09.01.) 6. ) Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldhatatlan anyagként szabályozott pórusméretü kerámia-részecskéken vagy szabályozott pórusméretű üvegrészecskékeri rögzített formájú enzimeket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983.09.01.) 7. ) Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a transzamináz, mind az oxálacetát dekarboxiláz enzimet azonos oldhatatlan anyagon rögzítjük. (Elsőbbsége: 1983.09.01.) 8. ) Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a transzamináz enzimet, mind az oxálacetát dekarboxiláz enzi-7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
