193893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás virusellenes 2-dezoxi-2,2-difluorpentozil-nukleozid származékok előállítására
193893 (t-butil-dimetil-szililoxi) -1 -hidroxi-2-dezoxi-2,2-difluor-ribóz tetrahidro-furános oldatát. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 60 órán át keverjük, majd további 0,66 g (1,7 mmól) 3,5-bisz (t-butil-dimetil-szilil-oxi) - l-hidroxi-2- -dezoxi-2,2-difluor-ribózt adunk a reakcióelegyhez. Ezután az elegyet 6 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert vákuumban lepároljuk és a maradékot kismennyiségű dietil-éterrel egy éjszakán át keverjük. A kivált csapadékot vákuumszűréssel elválasztjuk, és a szürletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 70 g szilikagélen kromatografáljuk, eluensként kloroformot alkalmazva. A fő terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószer lepárlása után 1,0 g l-(6-klór-9H-purin-9-il)-3,5-bisz(t-butil-dimetil-szililoxi) -2-dezoxi-2,2-diflüör-ribózt kapunk. A termék szerkezetét NMR-spektruma alapján azonosítjuk. Tömegspektrum = 477 [534- (t-butil) ]. B) 1- (6-Amino-9H-purin-9-il) -3,5-bisz (t-butil-dimetil-szililoxi) -2-dezoxi-2,2-difluor-ribóz 0,5 g (0,936 mmól) 1 -(6-klór-9H-purin-9- -il) -3,5-bisz (t-butil-dimetil-szililoxi) -2-dezoxi-2,2-difluor-ribóz 75 ml vízmentes etanollal készített oldatát 0°C hőmérsékleten vízmentes ammóniával telítjük. A reakcióedényt lezárjuk, és az elegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni.Ezután az elegyet 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az illékony komponenseket csökkentett nyomáson lepároljuk, és így 420 mg 1 - (6-amino-9H-purin-9-il) -3,5-bisz (t-butil-dimetil-szililoxi)-2-dezoxi-2,2-difluor-ribózt kapunk. Tömegspektrum = 458 [515-(t-butil) ]. C) 100 mg (0,194 mmól) 1-(6-amino-9H-purin-9-il) -3,5-bisz (t-butil-dimetil-szililoxi) -2- -dezoxi-2,2-difluor-ribóz 25 ml metilén-kloriddal készített oldatát 0°C hőmérsékletre hűtjük jégfürdő segítségével, majd vízmentes hidrogén-bromid gázzal telítjük. Az elegyet 0°C hőmérsékleten 4 órán át keverjük, és nitrogéngázt buborékoltatunk át az elegyen. Ezután szűrjük, és a szűredéket metanollal mosva 110 mg szilárd anyagot kapunk. Ezt HPLC segítségével tisztítjuk, és így 12,1 mg ß-1-(6-amino-9H-purin-9-il) -2-dezoxi-2,2-difluor-ribózt és 6,3 mg a-l-(6-amino-9H-purin-9-il)-2-dezoxi-2,2-difluor-ribózt kapunk. NMR-spektrum (ß-izomer): (CD3OD,30MHz) delta: 3,8—4,65 (m, 4H), 4,83 (széles, 4H),' 6,33 (dd, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,4 (s, 1H). Tömegspektrum m/e = 287. 16. példa All. példában leírtak szerint eljárva, az ott alkalmazott 5-metil-2,4-bisz(trimetil-szililoxi)-pírimidin helyett a megfelelő nukleozidot alkalmazva állíthatjuk elő az l-(2-amino-6-oxo-lH,9H-purin-9-il) -2-dezoxi-2,2-dif luor-ribózt. (m+H)/e: 304, 0857 (számított 304,0857). NMR-spektrum (CD3OD, 300 MHz), delta: 3,85—4,65 (m, 4H), 17 4,9 (széles, 5H), 6,15 (dd, 1H), 7,98 (s, 1H). 17. példa A 12. példában leírtak szerint eljárva, az ott alkalmazott (t-butil-dimetil-szililoxi)-védett vegyületek helyett a megfelelő benzoilcsoporttal védett vegyületekből kiindulva ugyancsak l-(2-oxo-4-amino-lH-pirimidin-l-il)-2- -dezoxi-2,2-trifluor-xilózt állítunk elő. A közbenső termékként keletkezett l-(4- -amino-2-oxo- lH-pirimidin- 1-il) -2-dezoxi-2,2- -difluor-3,5-dibenzoil-xilóz 'H-NMR-spektruma a következő: 'H-NMR-spektrum (300 MHZ, DMSO-d6)7 delta: 4,63—4,8 (m, 3H, C-4\ C-5‘), 5,75— 5,9 (m, 2H, C-3’, C-5), 6,38 (t, 1H, J=8Hz. C-F), 7,42—8,1 (multi m, 13H, Ph-H, C-6, N-H). ms = 471 (m+). Analízis a C23H19N306F2 képlet alapján: számított: C: 58,60, H: 4,06, N: 8,91, F: 8,06; talált: C: 58,34, H: 4,25, N: 8,71, F: 7,98. A találmányban szereplő vegyületek antivirális hatását in vitro vizsgálatokban mutathatjuk ki az alábbi módon: Afrikai kabóca-majmok vesesejtjeit (BSC-1) vagy Hela sejteket tenyésztünk 25 cm2-es Falcon edényekben 37°C hőmérsékleten 5% inaktívált magzati borjú szérumot (FBS, fetal bovine serum), milliliterenként 150 egység penicillint és 150 ml sztreptomicint tartalmazó 199-es táptalajon. Amikor egybefüggő egyrétegű tenyészet alakul ki, a tápközeg felülúszóját eltávolítjuk, és a megadott vírus megfelelő hígításából 0,3 ml-t adunk minden edényhez. Szobahőmérsékleten történő egy órás adszorbeáltatás után a vírussal fertőzött sejteket olyan tápközeggel fedjük le, ami 1 rész lonagar No. 2-ből és 2 rész, FBS-t, penicillint és sztreptomicint tartalmazó 199-es táptalajból áll. Ez a tápközeg tartalmazza a vizsgálandó vegyületet is a feltüntetett meg/ /ml koncentrációban. A vizsgálandó vegyületet nem tartalmazó edény szolgál kontrollként. A vizsgálandó vegyület törzsoldatát 104 mcg/ml koncentrációban dimetil-szulfoxidban készítjük el. Az edényeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán keresztül. Azokon a helyeken, ahol vírusfertőzés történt és a vírusok elszaporodtak a sejtekben, foltokat láthatunk. 10% formaiint és 2% nátrium-acetátot adva az edényekhez, inaktiváljuk a vírusokat és rögzítjük a sejtréteget az edény felületén. Miután a felületi foltok körül kristályibolyával megfestjük a sejteket, megszámoljuk a foltokat méretüktől függetlenül. Minden hatóanyagkoncentrációnál összehasonlítjuk a foltok számát a kontrolinál kapott adattal. A vegyület aktivitását úgy fejezzük ki, hogy hány százalékos gátlást eredményezett a foltok kialakulásában. Az eredményeket az 1—6. táblázatban mutatjuk be. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
