193887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enkefalináz-gátló szubsztituált alanin-származékok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
193887 majd 1,4 ml (10 mmól) trietil-amint és 20 mg N,N-dimetil-4-amino-piridint adunk. A kapott elegyet nitrogén atmoszférában 55—60°C-on keverjük 16 óra hosszat. A reakcióelegyet aztán vízbe öntjük és néhány alkalommal éterrel extraháljuk. Az egyesített éteres extraktumokat vízzel többször mossuk, szárítjuk és bepároljuk, így 5,7 g olajat kapunk.Ezt a terméket 400 g Merck silica gel G adszorbensen kromatografáljuk etil-acetát és hexán elegyeket használva eluálószerként. A vékonyrétegkromatográfiás analízis szerint tiszta frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk, így 4,2 g olajat kapunk; [a]£6 = —6,2° (c = 1,3, DMF). C) N- [L-l-(2,2-dimetil-l,3-dioxoian-4-ii-metoxi-karbonil)-2-feni!-etil] -L-fenil-alanin Az előző lépés termékét 50 ml tetrahidrofuránban oldjuk és Parr készülékben 0,4 g 10%-os palládium-szén jelenlétében szobahőmérsékleten 4,13 bar, 4 órán át hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk, így 3 g gyantás maradékot kapunk, amit etil-acetátból kristályosítunk, a kapott 2,6 g kristályos anyag 140—142°C-on olvad. D) N- [N-[L- [1- [(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4- -il)-metoxi] -karbonil] -2-fenil-etil] -L-fenil - -alanil] -ß-alanin-benzil-0szter Az előző lépés termékének 2,5 g-ját (5,8 mmól), 2,2 g (6,4 mmól) ß-alanin-benzil^szter-p-toluol-szulfonátot, 887 mg (5,8 mmól) 1-hidroxi-benzotriazol-hidrátot, 1,1 g (5,8 mmól) 1- (3-dimetil-amino-propil)-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és 23 ml (18 mmól) N-etil-morfolint tartalmazó elegyet 20 ml dimetil-formamidban egy éjszakán át keverünk szobahőmérsékleten. A kapott sárga oldatot vízre öntjük és néhány alkalommal éterrel extraháljuk. Az egyesített éteres extraktumokat vízzel többször mossuk, vízmentes kálium-karbonáton szárítjuk és bepároljuk, így 3,3 g olajat kapunk. Ezt az anyagot 300 mg Merck silica gel 60 adszorbensen kromatografáljuk hexán és etil-acetát 2:1 arányú elegyét használva eluálószerként. A vékonyrétegkromatográfiás analízis szerint (kovasavgél F254, etil-acetát : hexán = 1 : 1) homogén frakciókat egyesítjük és bepároljuk, így 2,7 g olajos terméket kapunk, amelyet a következő lépésben közvetlenül felhasználunk. E) N- [N- [L- [1- [(2,2-Dimetil-l ,3-dioxolan-4- -il)-metoxi]-karbonil] -2-fenil-etil] -L-fenil-alanil] -ß-alanin Az előző lépés termékéből 2,2 g-ot 50 ml abszolút etanolban oldunk és Parr készülékben 0,2 g 10%-os palládium-szén jelenlétében 3,45 bar nyomáson, szobahőmérsékleten 4 óra hosszat hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük és a szűrletet bepároljuk, így olajat kapunk, amely megszilárdul. Éterből —80°c-on végzett átkristályosítás után 1,8 g szilárd terméket kapunk, amely 80—82°C-on olvad; [ct]36 =—22,7° (c = 1, DMF). A vékonyrétegkromatogrammon egyetlen folt lát15 szik; Rf = 0,35 (oldószerelegy:kloroform : metanol : ecetsav = 500 : 25 : 2,5). F) N- [N- [L- [1- [(2,2-dimetil-í,3-dioxoIan-4- -il)-metoxi] -karbonil] -2-fenil-etil] -L-fenil - -alanil] -ß-alanin-maleät (1:1) Az előző lépés termékéből 5,0 g ot 200 ml éterben oldunk és 1,16 g maleinsav 200 ml éterrel készült oldatát adjuk hozzá. Az elegyet hűtőszekrényben, 5—10°C-on tartjuk egy éjszakán át, miközben a kristályképződés lassan megindul. A kristályokat szűrjük és szárítjuk, így 4,7 g sót kapunk, amely 127— 129°C-on olvad; [a]|6 = —16,3° (c = 1,DMF). A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek az enkefalinázoknak nevezett enzimek működését gátolják. A vegyületek különösen alkalmasak az enkefalináz A gátlására, amely a patkányok és emberek harántcsíkolt izomzatából származik. Az in vitro kísérletekben a kiválasztott I általános képletü vegyületek lO-9 és 10"6 mól koncentráció intervallumban a fentebb említett enzim működését 50 vagy annál nagyobb %-ban gátolták. A következő vizsgálati eljárásokat alkalmaztuk az I általános képletű vegyületek enkefalináz A gátló hatásának mérésére. Az enkefalin (ENK) lebontó aktivitását a következő 3 frakcióra bontottuk Gorenstein és Snyder [(Life Sei., 25, 2065 (1979)] módszere szerint: Enk’ase A (Gly3-Phe4), Aminjpeptidase (AP) (Tyr'-Gly2) és Enk’ase B (Gly-Gly3). Az enzim aktivitást úgy különítettük el, hogy Sprague-Dawley patkányokból az agyszövetet (minus cerebbellumt kivettük és 30 térfogat 50 mmólos trisz-pufferben (pH=7,4) Eírinkmann Polytrin segítségével homogenizáltuk. A kapott homogenizátumot 50 000 g-n 15 percig centrifugáltuk. A pasztillát, amely a membránhoz kötött enzim-anyagot tartalmazta 4 alkalommal újra szuszpendáltuk triszpufferben és újra centrifugáltuk. A mosást követően a membrán pasztillát úgy szolubilizáltuk, hogy 45 percig 37°C-on a kezdeti agy-súlyra számított 15 térfogat 50 mmólos trisz-l%-os Triton x-100 puffer jelenlétében (pH=7,4) inkubáltuk. 60 percig 100 000 x g-n centrifugáltuk a nem-szolubiizált anyag eltávolítására, majd a Tritonoldható felülúszót 1,5 x 30 cm DEAE Sephacel ídszorbenssel töltött oszlopra rétegeztük, amelyet 50 mmólos trisz-0,1% Triton oldattal (pH=7,4) egyensúlyba hoztunk. Az eluátumot 7 ml-es frakciókban szedtük. Az anyagot az oszlopról 1 liter lineáris nátrium-klorid gradienssel eluáltuk, amely 0,0-tól 0,4 mólig változott. Ilyen körülmények között az Enk’ase A aktivitás 120 és 200 ml között, az AP aktivitás 260 és 400 ml között, végül az Enk’ase B aktivitás 420 és 450 ml között eluálódott. Az enkefalin lebontó aktivitást radiometriás assay-vel követtük. A szubsztrát 3H-Met5- -ENK(50,1 Ci/mmól, New England Nuclear), 0,05 mólos trisz-pufferrel (pH=7,4) oly módon hígítva, hogy a reakcióelegy végső kon-16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
