193870. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a digitális lanata primer glikozidjainak szekunder glikozidokká történő átalakítására
193870 a. ) a friss vagy mélyhűtött Helix pomatia teljes téstéből közvetlenül vízzel szuszpenziót (homogenizátumot), kívánt esetben a szilárd részek eltávolításával kivonatot (felülúszót)-, b. ) a Digitalis lanata b, primer glikozidj(á/ai)ból bn rövid szénláncú alkanolban 0,5 mg/ /m 1-től a telítettségig terjedő koncentrációjú oldatot vagy b,2 mintegy 1-20 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót, vagy b2 növényből, előnyösen leveléből vízzel szuszpenziót készítünk. c. ) 10-50 tömegegységnyi Helix pomatia testéből az a.) lépés szerint készített szuszpenzióhoz (homogenizátumhoz), kívánt esetben kivonatához (felülűszó) 1 tömegegységnyi Digitalis lanata primer glikozidj(á/ai)nak a b.) lépés szerint készített oldatát vagy szuszpenzióját, vagy 1 tömegegységnyi primer glikozido(ka)t tartalmazó Digitalis lanata szuszpenzióját adjuk, adott esetben az adagolás sorrendjét felcseréljük, majd d. ) a.reakcióelegyet 25-45°C, előnyösen 33-39°C hőmérsékleten 0,3-20 órán át 4-7 közötti pH-értéken inkubáljuk, ily módon a Digitalis lanata szekunder glikozidj (á/ai) t kapjuk. A találmány szerinti eljárással készült reakcióelegyből a szekunder glikozidokat ismert módszerrel (pl. a 149 778 sz. magyar szabadalmi leírás) nyerjük ki,és szükséges esetben ugyancsak ismert eljárással (pl. 151 897 sz. magyar szabadalmi leírás) választjuk el. Eljárásunkkal nemcsak a Digitalis lanata primer glikozidjait alakíthatjuk át szekunder glikozidokká, hanem az egyéb Digitalis fajtákét, így például a Digitalis purpurea-ét is. A találmányunk szerinti eljárást az alábbi példákban mutatjuk be részletesen, anélkül, hogy oltalmi igényünket azokra korlátoznánk. 1. példa a.) Lanatozid-C digoxinná való enzimkatalitikus átalakítása Lanatozid-C kristályokból etanoiban 10 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk, amelyet vízzel és annyi Trisz-puffer és sósav oldat elegyével vagy citrát-puffér oldattal hígítjuk, hogy a lanatozid-C oldat végkoncentrációja 0,5 mg/ml, pH-értéke 5 legyen. 1 ml reakcióelegyhez ezután 100 pl, példánk b.) pontja szerint frissen készített Helix pomatia felülúszó enzimkatalizátor készítményt adunk, és 37°C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. A reakcióelegyből mintát veszünk, és az átalakulást vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk. Az átalakulás 100%-os. Az átalakulási folyamatot az alábbi módon detektáljuk: 5 4 Szilikagél vékonyréteg lemezre (Merck 5553 DC Alufolien Kieselgel 60) 50 pl-nyi mintákat viszünk fel és diklór-metán:metanol: :desztillált víz 85:13,5:1,5 arányú elegyében szobahőmérsékleten futtatjuk a lemez teljes magasságáig. A lemezt antimon-triklorid 25%-os kloroformos oldatával lefújjuk, majd 5 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. Az előhívott foltokat videodenzitometriáljuk TV-kamerás detektáláson alapuló videodenzitometriás műszeren (Telechrom-S), A glikozidtartalmat kalibrációs görbén határozzuk meg. A reakcióelegyből a digoxint egy ismert módszerrel (például a 149 778 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárással) nyerjük ki. b.) Helix pomatia enzimkatalizátor készítmény 100 g Helix pomatia (éticsiga) 300 ml desztillált víz Friss vagy mélyhűtött Helix pomatiát használunk (elpusztult, megfeketedett éticsiga nem alkalmas). Házától megfosztott 100 g-nyi csigát 300 ml desztillált vízben szobahőmérsékleten 10.000 ford/perc sebességgel ETA-012 típusú mixerben 3 percig turmixolunk. Ily módon homogenizátumot kapunk. A homogenizátumot 30 percig 10.000 gyorsulással centrifugáljuk, és a felülúszót alkalmazzuk katalizátorkészítményként. A homogenizátumot—, vagy a felülúszó katalizátorkészítményt rövid időn belül fel kell használni, ezért előnyösebb mindkettőt fagyasztott állapotban tárolni, ily módon ugyanis több hónapon át aktív állapotban marad. Igen előnyös készítményt oly módon állíthatunk elő, ha a homogenizátumot, vagy a felülúszót egy ismert módszerrel liofilizáljuk, ebben az esetben a készítmény aktivitását legalább egy évig megőrzi. 2. példa Lanatozid-A digitoxinná történő enzimkatalitikus átalakítása Az 1. példa a.) pontja szerint járunk el, azzal a változtatással, hogy lanatozid-C helyett kiindulási anyagként lanatozid-A-t és etanol helyett metanolt alkalmazunk. Az átalakulás és a reakcióelegyben jelenlévő termék tisztasága az 1. példával azonos. 3. példa Lanatozid-B gítoxinná történő enzimkatalitikus átalakítása Az 1. példa a.) pontja szerint járunk el, azzal a változtatással, hogy lanatozid-C helyett kiindulási anyagként lanatozid-B-t és etanol helyett metanolt alkalmazunk. Az átalakulás és a reakcióelegyben jelenlévő termék tisztasága az 1. példával azonos. 4. példa Lanatozid-C digoxinná történő enzimkatalitikus átalakítása 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
