193812. lajstromszámú szabadalom • Eljárás korrinoidok elválasztására
dók megkötődnek a gyantán. A sejt-törmeléket, a szerves és szervetlen kisérő anyagokat a megkötéssel azonos irányban vízzel kimossuk a gyanta oszlopokból. Ezután az oszlopokra 20 liter, összesen 3 g kálium-cianidot tartalmazó vizes oldatot nyomatunk fel, a korrínoidok ciano-formájának kialakítása céljából. 10 perc állás után leengedjük az oszlopokról a kálium-cianid tartalmú vizet és 100 liter vízzel átmossuk a gyanta oszlopokat. Az adszorbciós gyantáról a cianokorrinoidokat 100 liter 90 tf%-os metanollal oldjuk le, felülről történő folyamatos rávezetéssel. A metanolos eluátumból a metanolt 50°C-t meg nem haladó hőmérsékleten lepároljuk. A 10 liter vizes sűrítmény 23 g B12-vitamint, 4 g III. faktort és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz. B) A találmány szerinti eljárás kiviteli példái 1. példa 1 m2 3 fermentléből az A) c) pontban leírtak szerint nyert 10 liter vizes sűrítményt, amely összesen 27 g kobalamint és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, tömény ammónium-hidroxiddal pH=9,5-re lúgosítunk, majd 50 g kálium-metabiszulfitot adunk az oldathoz. Ezután az oldatot 5 liter/óra sebességgel átengedjük 5 liter DIAION HP-20 gyantából készült 100x1000 mm méretű adszorbciós oszlopon, majd 5 liter olyan vízzel mossuk az adszorbens oszlopot, amelyet pH=9,5-re lúgosítottunk tömény ammónium-hidroxiddal és I g/liter kálium-metabiszulfitot oldottunk fel benne. Ezután vízzel semlegesre mossuk a gyanta oszlopot. A gyantán átfolyt oldat és a vizes mosó oldatok tartalmazzák a kiindulási oldatban lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét, míg a kobalaminok a gyantán adszorbeálódnak. A kobalaminokat ismert módon 2 liter 90 tf%-os vizes metanollal eluáljuk. A metanol lepárlása utáni vizes oldat 25 g kobalamint tartalmaz, hozam 92,6% a kiindulási vizes sűrítmény kobalamin tartalmára vonatkoztatva. 2. példa 1,5 m3 fermentléből az A) c) pontban leírtak szerint nyert 15 liter vizes sűrítményhez, amely 40,5 g kobalamint és 177 g inkomplett korrinoidot és a metanol nagy részének a lepárlása után még 5% metanolt tartalmaz, 150 ml 10%-os kálium-cianid oldatot adunk, a pH-t 10,0-re állítjuk 2 N nátrium-hidroxiddal. A fenti oldatot 6 liter Amberlite XAD-2 adszorbciós gyantából készült oszlopon engedjük át 6 liter/óra sebességgel, majd 10 liter vízzel mossuk a gyanta oszlopot.. Az átfolyt lé és a mosóvíz tartalmazza az inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét. A gyantán adszorbeált kobalaminokat 6 liter 80 tf%-os vizes metanollal ismert módon eluáljuk. Az eluátumból a metanolt lepárolva olyan vizes olda tot nyerünk, amely 36,45. g kobalamint tartalmaz. A kiindulási vizes sűrítmény kobalamin tartalmára vonatkoztatott hozam 90%. 7 3. példa 1000 liter fermentléből az A) b) pontban leírtak szerint előállított korrinoidokat, a sejtfeltárás során oldatba ment anyagokat és sejttörmeléket tartalmazó vizes elegyet, amely 32 g kobalamint és 118 g inkomplett korrinoidot tartalmaz, pH-értéke 4,0, mozgóágyas technológiával alulról felfelé átáramoltatjuk 20 liter DIAION SP 207 adszorbciós gyanta oszlopon, 200 liter/óra sebességgel. Ekkor a fermentléből pz összes korrinoid megkötődik a gyantán. A sejttörmeléket, a szerves és szervetlen kisérő anyagokat a megkötéssel azonos irányban áramló vízzel kimossuk a gyanta oszlopból. Ezután az oszlopon felülről lefelé 200 liter olyan vizes oldatot engedünk, át, amely 0,1% kálium-cianidot tartalmaz és pH értéke 9,5, aceton tartalma 4 tf%. Ezután 200 liter vízzel átmossuk a gyanta oszlopot. A kálium-cianidot tartalmazó lúgos mosóoldat és az azt követő vizes mosóoldat tartalmazza a kiindulási lében lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét. Az adszorbciós gyantáról a cianokob^laminokat ismert módon 60 tf%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az aceton lepárlása után kapott vizes oldat kobalamin tartalma 28,5 g a kiindulási tisztított és feltárt fermentlé kobalamin tartalmának 89%-a. 4. példa Az A) a) pontban leírtak szerint nyert, 23 g kobalamint és 88 g inkomplett korrinoidot tartalmazó 1000 liter nyers, feltárt, centrifugálásal csapadékmentesített fermentlé pH-ját nátrium-hidroxiddal 9,0-re állítjuk be és 50 g nátrium-cianidot oldunk benne, majd alulról felfelé, mozgóágyas technológiával átáramoltatjuk 40 liter DIAION SP 207 adszorpciós gyantából készült oszlopon a kobalaminok megkötése céljából. Az inkomplett korrinoidok ilyen körülmények között nem adszorbeálódnak a gyantán. Az adszorbenst szintén alulról felfelé, mozgóágyas technológiával vízzel kimossuk, majd a cianokobalaminokat 90 tí%-os metanollal ismert módon eluáljuk. Az eluátum 20,24 g cianokobalamint tartalmaz. A kiindulási feltárt fermentlére vonatkoztatott kobalamin hozam 88%. 5. példa Az A) c) pontban leírtak szerint tisztított, illetve ciano-vegyületté alakított 10 liter vizes oldatot, amely 27 g kobalamint és 99,7 g inkomplett korrinoidot tartalmaz 1 N nátrium-hidroxid oldattal pH=9,5-re lúgosítjuk, 50 g kálium-metabiszulfitot oldunk fel benne, majd 4 liter, kismértékben poláros, akrilészter-polimer DIAION HP2MG gyanta oszlopon engedjük át. A gyantaoszlopot ezután vízzel semlegesre mossuk. Az átfolyt lé és a lúgos mosóvíz tartalmazza a kiindulási anyagban lévő inkomplett korrinoidok teljes mennyiségét. Ezután a kobalaminokat ismert módon 65 tf%-os etanollal eluáljuk az adszorbciós gyantáról. Az eluátum 23,2 g kobalamint tartalmaz. A kiindulási vizes sűrítmény hatóanyag tartalmára vonatkoztatott hozam 86%. 8 5 193812 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
