193624. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új tieno-triazolo-1,4-diazepin-2-karbonsavamidok előállítására
193624 3,8%-os nátrium-citrát-oldat van. A nátrium-citrát-oldat és a vér aránya 1:9. Alapos összekeverés után a citrátos vért 20 percig centrifugáljuk 150 g-n (1200 fordulat/perc). Atrombocitaaggregációt Born és Cross módszerével (Born, G.V.R. Gross, M.J.: J. Physiol., 168, 178 (1963)) mérjük, úgy, hogy a trombocitában gazdag plazmához állandó keverés közben hozzáadjuk az aggregációt kiváltó PAF-t. A vizsgálandó vegyületet mindig az aggregáció kiváltása előtt 2-3 perccel adjuk az oldathoz 10 p.1 mennyiségben. Oldószerként desztillált vizet, etanolt és/vagy dimetil-szulfoxidot alkalmazunk. A kontroliadag az oldószer megfelelő mennyiségéből áll. A kiindulási abszorpció észlelése után (2-3 perc) az aggregációt PAF-hozzáadásával (5 x 10-®M) indukáljuk. A vegyület hatásának értékelésére az első aggregációs hullám maximumát használjuk. A PAF által kiváltott maximális abszorpciót (=maximális aggregáció x 100%) egyidejűleg mindig egy párhuzamos mérésben (=kontrollmérés egy kétcsatornás aggregométer egyik csatornáján) megvizsgáljuk minden tesztmérésnél (másik csatorna) és mint 100%-ot vesszük alapul. A tesztmérésben a vizsgált vegyülettel elért aggregációértéket a 100%-ból kivonva adjuk meg. Minden vizsgálandó anyagot 10“3 - 10~8 M koncentrációértékekben,szúrópróbaszerűen — n értéke mindig 4 — vizsgálunk meg a PAF által indukált trombocitaaggregációt gátló hatás szempontjából. Ezután koncentráció — hatásgörbét szerkesztünk 3 koncentráció alapján, és meghatározzuk az IK50-et (az a koncentráció, amelynél az aggregációgátlás 50%-os). Az (I) általános képletű vegyületek I K-értékei 0,17 és 1,5 p.M között mozognak. Különösen hatásos vegyületeknek bizonyultak a 3-14- (2-klór-fenil) -9-metil-6H-tieno [3,2-f] [1,2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-2-il]-propionsav-dietil-amid (IK50=0,7) és a 3- [4-(2-klór-fenil) -9-metil-6H-tieno[3,2-f] [1, 2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-2-il]-propion sav-morfolid (IK50=0,17). 11. In vivo vizsgálatok 11.1. PAF által kiváltott bronchokonstrikció antagonizálása narkotizált tengerimalacokon Spontán lélegző, 300-450 g súlyú hím tenrimalacokat 1 órával a PAF intravénás infúziója [30 ng/(kg x perc)] előtt a vizsgálandó vegyülettel vagy kontrollanyaggal kezelünk orálisan. A kísérleti állatokat ezután 2 mg/kg uretánna! intraperitoneálisan anesztetizálunk, igy a vena jugularis-ba, az artéria carotis-ba és a trachea-ba kanült vezethetünk be. A PAF-infúzió a kontrollcsoportnál erős, hosszan tartó bronchokonstrikciót okoz, amely a belélegzett levegő mennyisége, a compliance- és a resistance-értékek alapján mérhető, ezenkívül vérnyomáscsökkenést is kivált. A halál 4 5 körülbelül 7-10 perc után áll be. A leírt PAF-antagonistákkal a légzésre és a vérnyomásra kifejtett hatás, valamint a halál beállta meggátolható. Az ehhez szükséges dózisok: 0,5-5 mg/kg p.o. és 0,5-1,0 mg/kg i.v. 11.2. PAF által kiváltott vérnyomáscsökkenés antagonizálása narkotizált patkányokon Normotóniás, 200-250 g súlyú hím Wistar patkányokat intraperitoneálisan anesztetizálunk 2 mg/kg uretánnal. Az artéria carotis-t és a vena jugularis-t kanülözzük. Egy intravénás PAF-infúzió [30 ng/(kg x perc) ] a kontrollcsoportnál erős, hosszantartó vérnyomáscsökkenést vált ki. Ezt intravénás injekcióval dózisfüggően (kumulatív beadás) megszüntethetjük a leírt vegyületeket 0,01-0,5 mg/ /kg dózisban alkalmazva. A vegyületet orálisan vagy intravénásán beadva a PAF-infúzió elkezdése előtt annak vérnyomáscsökkentő hatását dózisfüggően gátolni lehet. 11.3. PAF-indukált csalánkiütés antagonizálása patkányokon (Koelzer és Wehr módosított módszere, Koelzer, P.P., Wehr, K.H.: Arzneim.-Forsch., 8, 181, (1958)) Egy intrakután beadott PAF-injekció csalánkiütést okoz, ami a PAF által megnövelt véredénypermeabilitás megnyilvánulása. 250±20 g súlyú hím Wistar patkányok hasi szőrzetét rövidre vágjuk. Azután 1 ml/kg mennyiségben 1%-os tripánkék-oldatot fecskendezünk a farokvénába. A középvonalhoz (liriea alba) képest szimmetrikusan 3 helyen, körülbelül 1,5 cm távolságra fiziológiás konyhasóoldatot vagy PAF-oldatot (12,5-25,0 ng/ /hely 0,1 ml-ben) adunk be intrakután injekcióban. Míg a konyhasóoldat beadásának helyén semmilyen reakció nem lép fel, a PAF egy bőrreakciót (csalánkiütést) vált ki, amely különböző erősségű kékre színeződés révén — a PAF-dózistól függően — láthatóvá válik. Ezt a PAF által kiváltott bőrreakciót meg lehet gátolni a leírt vegyületek egyidejű intrakután beadásával 0,5-5 pg/hely (0,1 ml-ben) dózisban, vagy intravénás előkezeléssel 0,2- -3 mg/kg dózisban. III. Központi idegrendszerre kifejtett hatás Általánosan ismeretes, hogy az ilyen szerkezetű vegyületek központi idegrendszeri hatásokat váltanak ki, amelyek azonban egy PAF-antagonista hatású vegyületnél nem kívánatosak. A leírt vegyületeket ezért hipnogén és antikonvulzív hatásuk szempontjából, valamint a locomotio-ra kifejtett hatásuk szempontjából vizsgáltuk. A lehetséges hipnotikus hatást 400-450 g súlyú tengerimalacokon vizsgáltuk. 200 mg/kp p.o. dózisig terjedő mennyiségben a vegyületek nem okoztak hipnotikus vagy szedatív hatást ezeken az állatokon. Az antikonvulzív hatás vizsgálatára a pentetrazol-antagonizmus jelenségét használhat-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
