193585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok és makroorganizmusok sejtkultúráinak tenyésztésére alkalmas szilárd táptalajok előállítására
193585 diffúziós folyamatokat tesz lehetővé az egymástól elválasztott kamrák között. Ugyanakkor meg van a lehetőség többkomponensű rendszerek esetében az egymás között vagy a környezettel lejátszódó kölcsönhatás, valamint az élő organizmusokat befolyásoló különböző hatások vizsgálatára is. Egy üreget tartalmazó kamrák esetében az üregeket koaxiálisán képezzük ki. A fenti módon előállított kamrákat makro- és mikroorganizmusok sejtjeinek in vivo és in vitro tanulmányozására alkalmazzuk. E célból a kamrák üregébe például injekcióstű segítségével, a fal átszúrása után például lyphoid szervek (pl. lép, nyirokcsomó, thymus, csontvelő) sejtjeit juttatjuk, majd a kamrát a recipiens szervébe implantáljuk. Meghatározott idő után kivesszük és mikroszkopikus úton megfigyeljük a sejtorganizációt, valamint a kultúrák jellegzetességeit. A kamrafal átszúrásával a sejtek az egyes üregekből kivehetők és morfológiájuk, valamint funkcionális tulajdonságaik megvizsgálhatok. Csontvelősejtek in vivo tenyésztésénél sikerült a sejtek növekedését 1 hónapon át megfigyelni és megállapítani, hogy ez az idő jelentősen hosszabb, mint a más anyagból készült kamrák esetében mért túlélési idő. A következő példákban a találmány szerinti eljárást mutatjuk be részletesebben. 1. példa A poliakrilamid-gél előállításához három oldatot (A, B, C) készítünk a következőképpen (a kiindulási anyagok megadott mennyiségeit minden esetben 1000 ml oldatra vonatkoztatjuk) : A) oldat készítése 5 ml N,N,N’,N’-tetrametil-etilén-diamint 995 ml 0,85%-os vizes nátrium-klorid oldatban oldunk és fénytől védve 4°C hőmérsékleten tároljuk. B) oldat készítése 0,594 g N,N’-metilén-bisz-akrilamidot 500 ml 0,85%-os vizes nátrium-klorid oldatban oldunk, hozzáadunk 470 g akrilamidot és addig melegítjük 60°C hőmérsékleten, amíg teljesen feloldódik. Ekkor a kapott oldatot szűrjük és 0,85%-os vizes nátrium-klorid oldattal 1000 ml-re egészítjük ki. Az oldatot fénytől védve, 4äC-on tároljuk. 7 C) oldat készítése 1,78 g peroxi-szulfátot 100 ml 0,85%-os vizes nátrium-klorid oldatban oldjuk és fénytől védve tároljuk. A fenti módon készített oldatokból állítjuk össze a reakciókeveréket a következő arány szerint keverve őket: A : B : C = 16 : 31 : 52. Az oldatok ilyen arányú keverése esetében a monomerek tömegaránya akrilamid : N, N’-metilén-bisz-akrilamid = 15,0 : 0,019, és a monomerkeveréknek a fiziológiás oldathoz viszonyított tömegaránya 1 : 6. A fenti reakciókeveréket 200 ml-es reaktorba öntjük, és meghatározott átmérőjű poliakrilamid-gél tárcsákat állítunk elő. A polimerizációs reakció 40 perc alatt végbemegy. A kapott tárcsákat fiziológiás oldattal átmossuk, és 0,85%-os nátrium-klorid oldatban tömegük 4,5-szörösére duzzasztjuk. Ekkor a poliakrilamid-gél a következő összetételű: Akrilamid-N, N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimer 3,3 tömeg% Fiziológiás oldat 96,7 tömeg%. A fenti jellemzőjű gélből ezután Hottinger-féle szilárd táptalajt készítünk. Ehhez a tárcsákat üvegedénybe helyezzük,és Hottinger-féle 200 mg% aminonitrogént tartalmazó tripszin emésztési-húsleves folyékony tápközeggel leöntjük, minden tárcsára 200 ml oldatot számítva, majd 2-3 órán át állni hagyjuk. Ezután az átitatódott tárcsákat gőzzel, nyomás alatt, 120°C hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk. Az így. felhasználásra kész táptalajt a vizsgálandó mikroorganizmusokkal beoltjuk. A kísérletnél a következő törzseket használjuk: St. aureus 209, E. coli K-12, E. coli M-17, Sh. flexneri, Bac. cereus 504, Bac. subtilis, Candida albicans. Kontrollként ugyancsak a fenti mikroorganizmusokat, a 977466 számú szovjet szerzői tanúsítványban leírt eljárással előállított poliakrilamid-gélből készített táptalajon tenyésztjük. A táptalajok a felhasználás során nem sérültek meg, a mikroorganizmusok jellegzetes növekedést mutattak, a táptalajba nem nőttek bele és bakteriológiai kaccsal a levételük igen könnyen ment. A következő 1. táblázatban összefoglaljuk a különböző mikroorganizmusok esetében mért növekedési intenzitásokat a találmány szerinti eljárással, valamint a 977466 számú szovjet szerzői tanúsítvány szerinti eljárással előállított táptalajokon meghatározva. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5
