193528. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978C ciklusos peptid-acil-származékok előállítására
193528 9 Kazein enzimatikus hidrolizátuma* 3,0 g Marhahúskivonat 0,5 g Glükóz 12,5 g Kukoricakeményítő 5,0 g Hús-pepton 5,0 g Melasz 2,5 g MgS04.7H20 0,25 g CaC03 1,0 g Czapek-féle ásványi törzsoldat 2,0 ml Agár 20,0 g Ionmentesített víz 1 literig *N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. A ferde agart beoltjuk Actinoplanes utahensis NRRL 12052-vel és 30°C-on 8-10 napig inkubáljuk. A ferde agaron nőtt tenyészet felével beoltjuk az alábbi összetételű 50 ml vegetatív táptalajt: Alkotórészek Mennyiség, Előfőzött zabliszt 20,0 g Szacharóz 20,0 g Élesztő 2,5 g Szárított szeszgyári gabonatörköly* 5,0 g K2HP04 1,0 g Czapek-féle ásványi törzsoldat 5,0 ml Ionmentesített víz 1 literig, a pH-t nátrium-hidroxiddal 7,4-re állítjuk be; autoklávozás után a pH körülbelül 6,8. *National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N.Y. A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml-es bőnyakú Erlenmeyer-lombikban 30°C-on mintegy 72 óráig inkubáljuk, 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 fordulatot végző rázógépen. A fenti inkubált vegetatív táptalajjal közvetlenül beoltunk egy második fokozatú vegetatív táptalajt, vagy előnyösen félretehetjük későbbi felhasználáshoz, a tenyészetet folyékony nitrogén gőzfázisában tartva. Ilyen tároláshoz a tenyészetet több kis fiolában állítjuk elő a következőképpen: mindegyik fiolába bemérünk 2 ml inkubált vegetatív táptalajt és 2 ml glicerin/laktóz oldatot (részletesen lásd W.A. Dailey és C.E. Higgens, ^Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen", Cryobiol. 10 364-367 (1973)). Az előállított szuszpenzióját a cseppfolyós nitrogén gőzfázisában tároljuk. Az így elkészített tárolt szuszpenziót (1 ml) használjuk 50 ml első fokozatú vegetatív táptalaj beoltására (melynek összetételét fentebb megadtuk). A beoltott első fokozatú vegetatív táptalajt a fentiek szerint inkubáljuk. Nagyobb térfogatú inokulum előállítása céljából az inkubált első fokozatú vegetatív Táptalaj 10 ml-ével beoltunk 400 mi második fokozatú vegetatív táptalajt, melynek öszszetétele azonos az első fokozatúéval. A második fokozatú táptalajt 2 literes' bőnyakú Erlenmeyer-lombikban 50°C-on 48 óráig inkubáljuk 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen. A fentiek szerint előállított, inkubált második fokozatú vegetatív táptalajjal (80 ml) beoltunk 10 liter steril szaporító táptalajt, melynek összetétele az alábbiak egyike: 10 I. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Földimogyoróliszt 10,0 Oldható hús-pepton 5,0 Szacharóz 20,0 kh2po4 0,5 k2hpo4 1,2 MgS04.7H20 0,25 Csapvíz 1 literig 121°C-on 45 percig mintegy 110-124 kPa nyomás alatt végzett autoklávozás után a táptalaj pH-ja körülbelül 6,9. II. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Szacharóz 30,0 Pepton 5,0 k2hpo4 1,0 KC1 0,5 MgS04.7H20 0,5 FeS04.7H20 0,002 Ionmentesített víz 1 literig A pH-t HCl-val 7,0-re állítjuk klávozás után a pH körülbelül 7,0. be; auto-III. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per I) Glükóz 20,0 NH4C1 3,0 Na2S04 2,0 ZnCl2 0,019 MgCl2.6H20 0,304 FeCl3.6H20 0,062 MnCl2.4H20 0,035 CuCl2.2H20 0,005 CaC03 6,0 kh2po4* 0,67 Csapvíz 1 literig *Külön sterilizálva és fertőző anyagoktól mentesen hozzáadva. Végső pH körülbelül 6,6. A beoltott szaporító táptalaj fermentációját 14 literes fermentorban mintegy 30°C-on körülbelül 66 óráig folytatjuk. A fermentációs közeget szokásos keverőkkel körülbelül 600 ford/min sebességgel keverjük és steril levegővel levegőztetjük úgy, hogy az oldott oxigén szintjét 30%-os levegőtelítés felett tartsuk légköri nyomáson. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
