193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
A találmány hőstabil alfa-amiláz enzimet kódoló génnel rendelkező kiméra plazmidokkal és előállításukkal foglalkozik. A gén klónozása Escherichia coli vagy Bacillus subtilis mikroorganizmusba, és az így keletkezett mikroorganizmusok alkalmazása hőstabil alfa-amiláz termeléséhez szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány háttere Nagyipari mennyiségben gyártanak glükóztartalmú szirupot a kukoricakeményítő hidrolízisével A folyamat első lépését általában a keményítő-víz keverék alfa amilázos kezelésével végzik el a víz forráspontjához közeli hőmérsékleten. Ezen hőmérsékleten a hőstabil alía-amilázok a leghatásosabbak. Ezért valóban ösztönző feladat alacsony költségű forrást találni ilyen hőstabil enzim előállításához. A gyártásban használt alfa-amilázokat különböző mikroorganizmusok termelik. Ismere tes, hogy ezek a mikroorganizmusok olyan genetikai anyagot tartalmaznak, amelyek kódolják az enzim termelését ebben az organizmusban Ez a genetikai anyag dezoxiribo-nukleinsavak formájában van jelen a sejten belül. A dezoxiribo-nukleinsavakat ezután DNS-nek rövidítjük Egy baktériumban legtöbb genetikai anyag óriási DNS molekulák formájában, a sejt kromoszómájaként van jelen. A genetikai anyag egy bizonyos mennyisége azonban kisebb, zárt köralakú DNS molekulák formájában is jelen lehet, amelyeket plazmidoknak nevezünk A genetikai technikának (genetic enginee ring) nevezett műveletek segítségével a DNS egy szakaszát lehetséges átvinni egyik organizmusbóla másikba Több kutató kísérletezett azzal, hogy felhasználja ezt a technikát olyan mikroorganizmusok kifejlesztésére, amelyek kiemelkedő alfa-amiláz termelő képességet mutatnak Az egyik felhasznált technika az, hogy eltávolítják a teljes (vagyis kromoszómális és plazmid) DNS készletet az amiláz termelőnek ismert mikroorganizmusból. Az ebből a DNS-ből nyert fragmenseket összekapcsolják bakteriofágok DNS-ével A kombinált DNS-t tartalmazó bak teriofágokkal más mikroorganizmusokat fertőznek meg így ez a bakteriofág átviszi a genetikai anyagot a megfertőzött mikroorganizmusok kromoszómális DNS-ébe A megfertőzött mikroorganizmus sejtjei, amelyek aktív amilázgent tartalmazó DNS-t fogadtak be, amíláz termelővé válnak Ezeket a sejteket szelektálják és további alkalmazásokhoz növesztik Egy másik, hőstabil alfa-amilázhoz használt genetikai technika abban áll, hogy az ilyen amilázok termelőjeként ismert mikroorganizmusokból kivonják a DNS teljes mennyiségét, majd a DNS bizonyos fragmenseit transzformálják egy új gazda-mikroorganizmusba, amely által ezek a fragmensek beépülnek a gazda-mikro organizmusok kromoszómájába. Ezután azokat a sejteket, amelyekbe az aktív amilázt kódoló genetikai anyag beépült, szelektálják és növesztik 1 Arra jöttünk rá, hogy a hőstabil alfa-amilázt kódoló gén egy természetesen előforduló plazmában is létezik. Sőt, arra is rájöttünk, hogy az ilyen természetesen előforduló, hőstabil alfa-amilázt kódoló gént tartalmazó genetikai anyag közvetlenül kombinálható egy másik, vektor plazmidnak nevezett plazmiddal Ez a kombináció egy szintetikus, a továbbiakban kiméra plazmidnak nevezett plazmidot eredményez. Ezt a kiméra plazmidot be lehet iktatni egy új mikroorganizmusba, és ott megsokszorozni. Ez lehetővé teszi olyan mikroorganizmus kifejlesztését, amely kiemelkedő alfa-amiláz termelőképességgel rendelkezik, és amely könnyen növeszthető ipari méretekben. A jelen találmány az újonnan felfedezett, természetesen előforduló, alfa-amilázt kódoló génekkel rendelkező plazmidokkal, az ezek genetikai anyagát tartalmazó kiméra plazmidok előállításával és az ezeket a plazmidokat tartalmazó mikroorganizmusok kifejlesztésével foglalkozik. A találmányt röviden a következőképpen foglalhatjuk össze, a jelen találmánnyal kapcsolatban egy hőstabil alfa-amilázt kódoló gént tartalmazó kiméra plazmid készítésének folyamatát mutatjuk be. Ennek első lépése egy természetesen előforduló, hőstabil alfa-amilázt kódoló gént tartalmazó plazmid DNS elhasítása, amely lépés során alfa-amiláz gént kódoló lineáris DNS szekvencia alakul ki. Egy vektort elhasítva egy másik lineáris DNS szekvenciát alakítunk ki. Végül a két lineáris DNS szekvenciái összekapcsoljuk, így kapjuk meg a kiméra plazmidot. A nyert kiméra plazmid is szerepelhet hőstabil alfa- amilázt kódoló gént tartalmazó donorként. Az új kiméra plazmidot a donor DNS-ének elhasításával és a keletkezett DNS fragmensek hasonlóképpen elhasított vektorral kombinálásával nyerjük Végül a jelen találmánnyal kapcsolatban a hőstabil alfa-amiláz nagy teljesítményű készítésének folyamatát mutatjuk be Legalább egy alfa-amiláz gént tartalmazó kiméra plazmidot vezetünk be egy mikroorganizmusba A kimára plazmidot tartalmazó mikroorganizmust megfelelő tápközegben tenyésztjük, majd a tenyésztés során a mikroorganizmus által termelt alfa-amilázt izoláljuk. Ez a találmány tehát olyan eljárást mutat be, amelynek segítségével egy sejten belül hőstabil alfa-amilázt kódoló gének többszörös másolatát lehet előállítani. Ez az eljárás arra is lehetőséget nyújt, hogy amiláz géneket vigyünk át egy olyan mikroorganizmusba, amely sokkal könnyebben nő, mint a donor mikroorganizmus, így könnyen érhető el fokozott enzimtermelés A találmány részletes leírása A pontosabb értelmezés kedvéért megadjuk a különböző szakkifejezések definícióit. 1.) Természetesen előforduló plazmid Az itt alkalmazott „természetesen előforduló plazmid’’ szakkifejezés bármely, természetben 2 193516 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
