193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
LelFC Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF C plazmidból: (a) 35 bázispár hosszúságú, Sau 3a és Sau 96 közötti rész (b) >900 bázispár hosszúságú, Sau 96 és Pst I közötti rész (ej Elkülönítettünk egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (Hind III és Sau 3a közötti rész) a pLelF A-25 plazmidból a fentebb leírtak szerint. (d) Elkülönítettük a fentebbi, közelítőleg 3600 bázispárból álló töredéket. Előállítás (1) A fenti (a) és (c) pont szerinti töredéket összekapcsoltuk, majd a kapcsolási terméket elhasítottuk Bgl II és Hind III enzimmel, és elkülönítettük a körülbelül 335 bázispárból álló terméket. (2) A fenti (1), (b) és (d) pont szerinti három terméket összekapcsoltuk, és a kapott plazmid dal Escherichia coli törzset transzformáltunk Az így kapott jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLelF C trp 35 LelFD Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF D plazmidból: a) 35 bázispárból álló, Sau 3a és Ava II közötti rész b) 150 bázispárból álló, Ava II és Bgl II közötti rósz. c) Közelítőleg 700 bázispárból álló, Bgl II és Pst I közötti rész. Elkülönítettük a pLelF A25 plazmidból az alábbi töredéket: d) 300 bázispárból álló, Hind III és Sau 3a közötti rész. Elkülönítettük a pBR322 plazmidból az alábbi töredéket: e) Közelítőleg 3600 bázispárból álló, Hind III és Pst I közötti rész. Előállítás ( 1 ) összekapcsoltuk a fenti a) és b) pont szerinti töredéket, a terméket Bgl II enzimmel elhasítottuk, és a kapott,185 bázispárból álló terméket tisztítottuk. (2) Összekapcsoltuk a fenti (1) és d) pont szerinti terméket, az összekapcsolási terméket Hind III és Bgl II enzimmel hasítottuk. Tisztítás után közelítőleg 500 bázispárból álló terméket kaptunk. (3) A fenti (2) pont szerinti terméket öszekapcsoltuk a c) és e) pont szerinti töredékekkel, és a kapott plazmiddal Escherichia coli tör* zset transzformáltunk Egy így nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLelF D trp 11. Lel F F A LelF F-tartalmú töredéket annak alapjan állíthatjuk elő, hogy a LelF B és a LelF FI 13 számú aminosavjai teljesen homológok. A fentebb leírt pHGH 207 plazmidból megfelelő konfigurációjú végekkel rendelkező trp promotort tartalmazó töredéket (a) állítottunk elő Pst I és Xba I enzimmel végzett hasítás és a 15 körülbelül 1050 bázispárból álló töredék elkülönítése útján. Egy második töredéknek (b) a pHKY 10 plazmid Pst I és Bgl II enzimekkel vég zett hasításánál képződő töredékek közül a nagyobbikat vettük. (A pHKY 10 plazmid a pBR322 plazmid származéka, s tartalmaz egy Bgl II helyet a tetracikllnnel szembeni rezisztenciára vonatkozó promotor és a szerkezeti gén között.) Az (a) töredék tartalmazza az ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló génnek mintegy felét, a (b) töredék pedig e gén többi részét tartalmazza, továbbá a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló teljes gént, a promotor kivételével. Az (a) és (b) töredéket T4 ligázzal összekapcsoltuk, az összekapcsolási terméket Xbal és Bgl II enzimmel kezeltük a dimerizáció kiküszöbölésére. Ekkor a (c) töredéket kaptuk, amely a trp promotor-operátor rendszert, valamint a tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló géneket tartalmazza A pLelF F plazmid Ava II és Bgl II enzimekkel végzett feltárásával egy közelítőleg 580 bázispárból álló (d) töredékhez jutottunk. Ez a LelF F 14.-166. aminosavjaira vonatkozó kodonokat tartalmaz. A pLelF B plazmid Xbal és Ava II enzimekkel végzett hasítása útján az (e) töredéket kaptuk, amely 49 bázispárból áll. Az (e) töredék a LelF F 1.-13. aminosavját kódolja. A (c), (d) és (e) töredéket összekapcsoltuk T4 ligáz jelenlétében. Az illető töredékek kohéziós végei olyanok voltak, hogy a felépített plazmid megfelelően köralakú lett, és így a tetraciktinnel szembeni rezisztenciát kódoló gén az érett LelF F-re vonatkozó génnel együtt a trp promofor-operátor rendszer irányítása alá került. Ennek következtében a kívánt plazmiddal transzformáit baktériumokat tetraciklin tartalmú táp falajlemezeken lehetett kiválogatni. Egy ily mó don nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLelF F trp 1. LelF H Az érett leukocita interferon kifejezéséhez szükséges teljes LelF H gént a következőképpen állítottuk elő: 1. A pLelF H plazmidot Hae II és Rsa I enzimmel hasítottuk, és egy 816 bázispárból álló töredéket különítettünk.el, amely a 10 számú jel peptid aminosavtól a 3’ nem kódoló tartományig terjed. 2. A töredéket denaturáltuk, és Klenow töredékkel kezelve [Klenow és munkatársai Proc Natl. Acad Sei. USA, 65, 168 (1970)] bazispárosító szintézist végeztünk az 5' dATG TGT AAT CTG TCT szintetikus dezoxiribooligonukleotid alaprész alkalmazásával Ezt az altalános módszert Goeddel és munkatársai 1980. szeptember 25 én benyújtott, 190 799 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentése is tárgyalja 3. A kapott terméket Sau 3a enzimmel ha sítottuk, és egy 452 bázispárból álló töredéket különítettünk el Ez a töredék az 1 150 számú aminosavaknak felelt meg. 16 193512 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
