193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
Mintegy 30 pig (1 pmól) mennyiségű terméket (860 000 Cerenkov cpm) 0,5 p.g (5 pmól) Avall-Bglll töredékkel (150 bázispárból áll) és 1 ^g, (2 pmól) Bglll-Pstl töredékkel (670 bázispárból áll) kapcsoltuk össze, 20°C-on 16 órán át, 20 egység T4 DNS ligáz alkalmazásával. A ligázt ezután 10 percig 65“C-on történő hevítéssel inaktiváltuk. A reakcióelegyet Eco Rl és Pst I enzimmel kezeltük a gén polimerjei eltávolítása céljából, majd 6%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforózissel tisztítottuk. Mintegy 20 p.g (0,04 pmól) (36 000 cpm) terméket különítettünk el, amely 865 bázispárból állt A kapott termék felét ( 10 i±g) 0,3 |xg pBR322 plazmidhoz kapcsoltuk, az Eco Rl és Pst I részek közé, majd a terméket Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformációval 70 terméket kaptunk, amelyek tetraciklinre rezisztensek, ampicillinre érzékenyek voltak. Közülük 18 termékből elkülönített plazmid DNS-at EcoRI és Pst I enzimmel feltártunk. A 18 plazmid közül 16 esetben az EcoRI Pstl töredék 865 bázispár hosszúságú volt. Az egyikből (pLelF AI) 1 (j.g mennyiséget EcoRI enzimmel feltártunk, és 0,1 jo.g mennyiségű, 300 bázispárból álló EcoRI töredékhez kapcsoltunk. Ez utóbbi töredék az Escherichia coli trp promotort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazta, s a fentebb ismertetett módon lett előállítva. A trp promotort tartalmazó transzformált termékeket S2P izotóppal jelzett trp minta és a Grunstein- Hogness-féle telepvizsgáló eljárás alkalmazásával azonosítottuk |Grunstein és munkatársai Proc Natl. Acad. Sei (USA), 72, 3961 (1975)] A trp töredékben aszimmetrikusan elhelyezkedő Xba I hely lehetővé tette azoknak a rekombináns termékeknek a meghatározását, amelyekben a trp promotor a LelF A génnek megfelelően volt irányítva. A következőképpen készítettünk extraktumokat interferonvizsgálathoz: 1-1 ml tenyészetet szaporítottunk L húsleves táptalajon, amely 5 jj.g/ml tetraciklint tartalmazott. A szaporítást 1,0 körüli Asso-értékig. végeztük, majd 5 ng/ml tetraciklint tartalmazó 25 ml M9 táptalajjal hígítottuk. Amikor az A550 értéke 1,0 lett, 10-10 ml mintát különítettük el centrifugálással. A sejtszemcséket 1 ml 15%os szacharóz-oldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH=8,0) és 50 mM etilén—diamin—tetraecetsavat tartalmazott. 1 mg Irzozimot adtunk hozzá, 5 percig tartottuk 0°C-on, majd a sejteket ultrahanggal történő kezeléssel szétválasztottuk A mintákat 10 percig centrifugáltuk 15 000/perc fordulatszámon, Sorvall SM 24 rotor alkalmazásával. A felülúszó folyadék interferonaktívitását standard LelF mintákéval összehasonlítva határoztuk meg a citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata alapján. A sejtenkénti interferonrgolekulák számának meghatározásához 4x108 egység/mg fajlagos aktivitású leukocita interferont használtunk [Rubinstein és munkatársai, Proc. Natl Acad. Sei. (USA), 76, 640(1979)]. A pLelF A trp 25 klón, amelybe a trp promo 11 tort a kívánt irányítottsággal illesztettük be, nagy aktivitást mutat (2,5x108 egység per liter) A pLelF A trp 25 kiónt tartalmazó Escherichia coli K-12 törzs által termelt interferon autentikus emberi leukocita interferonként viselkedik; ellenáll a pH=2 értéken történő kezelésnek, és semlegesítik a nyúl antihumán leukocita antitestek. Az interferon látszólagos molekulasúlya közelítőleg 20.000. A kiegészítő dezÿxiribonukieinsavak elkülönítése további leukocita interferonok számára A teljesen jellemzett LelF A cDNS-tartalmú plazmidból DNS-at hasítottunk ki Pst I enzyp mel, elektroforétikus úton elkülönítettük és J p izotóppal megjelöltük [Taylor és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 442,324 (1976)]. A kapott, radioaktív izotóppal jelzett DNS-at felhasználtuk mintaként az Escherichia coli 294 törzzsel nyert további transzformált termékek vizsgálatához, in situ végzett telep-szűrő módszerrel (Grunstein és munkatársai, fentebb idézett hivatkozás). Azokat a telepeket különítettük el, amelyek az izotóppal jelzett mintával különböző mértékben hibridizálódtak. Ezekből a tenyészetekből és a fentebb hivatkozott tíz hib ridizáló tenyészetből a plazmid DNS-at Pst I en zimmel végzett hasítással különítettük el, és ha rom különböző módszerrel jellemeztük; Először, ezeket a Pst töredékeket a restrikciós endonukleáz enzimekkel (Bgl II, Pvu II és Eco Rl) való hasítási jellemzőkkel vizsgáltuk. Ez az analízis legalább nyolc különféle típusra való felbontást tett lehetővé (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF H). Ezzel megközelítettük a különböző restrikciós hasításoknak a jelenleg ismert LelF A előszekvenciához és kódoló szekvenciához viszonyított elhelyezkedését Úgy véljük, hogy az egyik típus, a LelF D azonos azzal, amelyről Nagata és munkatársai beszámoltak [Nature, 284, 316-320 (1980)| Másodszor, bizonyos dezoxiríbonukleinsa vakat hibridizációs kiválasztási teszttel vizsgáltunk [Cleveland és munkatársai, Cell, 20, 95 (1980)]. Ennél a tesztnél azt a képességet nézzük, amely biztosítja a LelF mRNS szelektív eltávolítását a KG-1 sejt ribonukleinsavját tartalmazó poli/A/ ból Harmadszor, az utóbbi Pst töredékeket be illesztettünk egy kifejeződő plazmidba, Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk a plazmiddal, és a törzs töredékeket fejezte ki A kapott termékek — feltehetően elő interferonok — mindegyike mutatott interferonaktivitast a CPE teszt során, bár a LelF F töredék esetében az aktivitás csekély mértékűnek bizonyult A fentieken túlmenően, valamennyi fentebb ismertetett leukocita interferon típus szekven ciáit is meghatároztuk. Második érett leukocita interferon Az érett LelF B-hez szükséges gént tártál mazó elkülönített töredék szekvenciája azt mu tatja, hogy a LelF A és LelF B első 14 nukleotid ja azonos. Ennek megfelelően felmerült az az 12 193512 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
