193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 poliakrilamid-géles frakcionálásból kapott poli(A) RNS termék is igen nagy számban tartalmaz különböző mRNS-eket. Az IFN-ß-re specifikus mRNS kivételével a többi jelenlevő mRNS-ek itt nem kívánatos szennyezésekként szerepelnek (1. ábra). Sajnos ezek a szennyező RNS-ek a találmány szerinti klónozási eljárás egész további folyamán a HuIFN-ß mRNS-hez hasonló módon viselkenek. Ezért ezeknek a poli (A) RNS-ben való jelenléte végülis arra vezet, hogy nagy számban kapunk nem kívánt bakteriális kiónokat, amelyek az IFN-ß-töl különböző polipeptidekre kódoló géneket tartalmaznak. Ez a szenynyezés bonyolult szűrési problémákat képez a kívánt IFN-ß hibrid kiónok izolálása szempontjából. Az IFN-ß esetében ez a szűrési probléma még súlyosabbá válik azltai, hogy nem áll rendelkezésre olyan kielégítően tisztított minta a HulFN-ß mRNS-ből vagy DNS-ből vagy ezek legalább egy részéből, amelyet szűrési mintának lehetne alkalmazni a kívánt kiónok azonosítása során. Ezért az IFN-ß kiónok kiszűrési eljárása igen időrabló és nehéz művelet. Emellett, minthogy az IFN-klónok csupán igen kis százalékától várható el, hogy az IFN-ß-t biológiailag vagy immunológiailag aktív alakban exprimálják, az ilyen aktív klón izolálási művelete egy „tűt a szénakazalban" kereső kiszűrési eljárásnak tekinthető. Előnyösen a rekombináns DNS-technikát alkalmazhatjuk arra a célra, hogy a HuIFN-ß mRNS vagy cDNS tisztított mintáját, vagy ezek valamely részének tisztított mintáját előállítsuk. Az így kapott tisztított mRNS vagy cDNS segítségével azután gyorsan szűrhetünk ki igen nagy számú bakteriális kiónt és ezzel jelentékenyen megnövelhetjük annak a valószínűségét, hogy olyan kiónt szűrünk ki, amely az IFN-ß-t aktív alakban exprimálja. IFN-ß cDNS-t tartalmazó kettősszálú cDNS szintézise IFN-ß mRNS-ben feldúsított poli(A) RNS- t használtunk templátként komplementer DNS („cDNS”) előállítására, lényegileg olyan módszerrel, amilyent R. Devos és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Full-Size DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNY", J. Mol. Biol., 128, 595—^619 (1979) közleményünkben egy MS2 RNS bakteriofág DNS-kópiát tartalmazó plazmid felépítésére leírtak. Egyszálas cDNS-t poIi(A) RNS-ből állítottunk elő, RNS-íüggő DNS-polimeráz (25 egység) segítségével; (ez utóbbit madár-mieloblasztózis-vírus („AMV") reverz transzkriptázból [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 213—214] nyertük) a reakciót az RNS poli (A)-végrészéhez hibridizált (dT)I0 primerrel (6 pg, a Miles cég gyártmánya) iniciáltuk, 50 pl 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =8,3), 10 mmol magnézium-kloridot, 30 mmol/1 ß-merkapto-etanolt, 4 mmol/1 nátrium-pirofoszfátot (Na2P207) és 2,5 pg/pl 10 17 inaktivált bovin szérum-albumint tartalmazó oldatban, 0,5—0,5 mmol/l dTTP, dATP, dCTP és dGTP, valamint a-32P-dATP (20 pCi, az Amersham cég terméke) hozzáadásával. Az elegyet 30 percig 41 °C hőmérsékleten tartottuk, majd 10 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav hozzáadásával a reakciót megszakítottuk, a reakcióelegyet ugyanolyan térfogatú 25:24:1 arányú fenol-kloroform-izoamilalkohol eleggyel extraháltuk, a vizes fázist egy Sephadex G50 oszlopra vittük, majd TE-pufferoldattal (10 mmol/1 trisz-HCI — pH= =7,5 — és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav oldata) eluáltuk. A rádióaktivitást mutató üres frakciókat 10 pg E. coli transzfer RNS, 0,2 mol/l kálium-acetát (pH=5,l) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk. A fenti módon szintetizált cDNS-populáció a valóságban különböző cDNS-ek komplex elegye; ezek a dúsított poli (A) mRNS- ben jelenlevő különböző mRNS-ekből származnak (vö.: 1. ábra). Emellett, az AMV reverz transzkriptáz általi idő előtti lezárás következtében számos így kapott cDNS a poli (A) RNS-ben jelenlevő különböző mRNS-ek inkomplett kópiája (ez az 1. ábrán nincs szemléltetve). Mielőtt a kapott cDNS-t kettősszálúvá tesszük, el kel! távolítani a komplementer templát-RNS-hez való asszociálódásból; ez oly módon történik, hogy a cDNS-t etanollal lecsapjuk, majd TE-pufferoldatban [10 mmol/1 trisz-HCL (pH=7,5), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav] T,-ribonukleázzal (10 egység, a Sankyo Co. Ltd. cég gyártmánya) és pankreász-A-ribonukleázzal (10 pg, a Sigma cég gyártmánya) 10 pl térfogatban 37°C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk; az alkalmazott ribonukleázok egyszálas specifikus endo- és exo-dezoxiribonukleázoktól mentes termékek. Azzal, hogy a templát-szálat alkáli helyett ribonukleázzal távolítjuk el, elkerülhető az alkáli által katalizált dezaminális folytán esetleg fellépő cDNS-mutáció. A cDNS-szál DNS-polimeráz-I segítségével tehető kettősszálúvá [A. Efstratiadis és munkatársai: „Enzymatic in Vitra Synthesis of Globin Genes”, Cell, 7, 279—288 (1976) ]. A fenti módon kapott 10 pl ribonukleáz/cDNS-elegyet 20 pl térfogatra hígítottuk 10 millimol/1 magnézium-kloridot, 10 mmol/1 DTT-t, 100 mmol/1 kálium-foszfátot (pH=6,9),0,3— 0,3 mmol/1 dATP-t, dCTP-t, dTTP-t és dGTP-t valamint 20 pCi 32P-dATP-t és 40 egység DNS-polimerázt (a Biolabs cég gyártmánya) tartalmazó oldattal. Az elegyet 6 óra hosszat 15°C hőmérsékleten-tartottuk, majd 10 mmol/1 koncentrációig etiléndiamin-tetraecetsavat és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot adtunk hozzá, majd a képződött kettősszálú cDNS-t fenol, kloroform és izoamilalkohol elegyével történő extrakció, Sephadex G50 oszlopon való kromatografálás és az üres frakciók lecsapása útján, a fentebb leírt módon elkülönítettük. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
