193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 Transzláció (lefordítás): Polipeptid képzése mRNS-ből. Expresszió: Az a folyamat, amelyen egy strukturális gén keresztülmegy, míg polipeptiddé alakul; ez tehát a transzkripció és a transzláció kombinációja. Plazmid: Egy nem-kromoszóma-jellegíí kettősszálú DNS-szekvencia, amely egy ép (intakt) „replikon”-t foglal magába, úgy, hogy a plazmid egy gazdasejtben replikálódik. Ha a plazmidot egy egysejtű szervezetbe helyezik, e szervezet jellemzői megváltozhatnak vagy átalakulhatnak a plazmid DNS- jének eredményeképpen. így például egy a tetraciklin-rezisztencia génjét (TetR) hordozó plazmid az eredetileg tetraciklin-érzékeny sejtet tetraciklin-rezisztens sejtté alakítja át. A valamely plazmid által átalakított sejtet „transzformáns"-nak nevezik. Fág vagy bakteriofág: Bakteriális vírus; számos ilyen fág egy fehérje-burokba kapszulázott DNS-szekvenciából áll („kapszid”) Klónozás-hordozó: Egy plazmid, fág-DNS vagy más DNS-szekvencia, amely egy gazdasejtben replikálódni képes és amelyet egy vagy néhány endonukleáz felismerési hely jellemez, amelynél az ilyen DNS-szekvenciák meghatározható módon felvághatok anélkül, hogy ezzel elveszítenék a DNS valamely lényeges biológiai funkcióját, például a replikációt, bevonat-fehérjék képzését, vagy pedig promotort vagy kötő-helyeket veszítenének, és amelyek egy a transzformált sejtek azonosítására alkalmas jelzőt (marker) tartalmaznak, mint amilyen a tetraciklin-rezisztencia vagy az ampicillin-rezisztencia. A klónozás-hordozót gyakran vektornak is nevezik. Klónozás: Organizmus-populációk vagy DNS-szekvenciák nyerése egyetlen ilyen organizmusból vagy szekvenciából ivartalan (aszekszuális) szaporítás útján. Rekombináns DNS-molekula vagy hibrid DNS: Különböző genomokból származó DNS-szegmensekből álló molekula, amelyben ezek a szegmensek élő sejteken kívül kapcsolódtak egymáshoz végeikkel és amely képes megfertőzni egy gazdasejtet és fennmaradni abban. Expresszió-szabályozó szekvencia: Nukleotidok oly szekvenciája, amely ellenőrzi és szabályozza a strukturális gének expresszióját, ha operatív módon kapcsolódik ezekhez a génekhez. Az expresszió-szabályozó szekvenciák sorába a lac-rendszer. a Vfág nagyobb operátor- és promotor-tartományai, az fd burok-fehérje szabályozó tartománya és más olyan szekvenciák tartoznak, amelyekről ismeretes, hogy szabályozzák a prokariotikus vagy eukariotikus sejtek és vírusaik génjeinek expresszióját. Az 1. ábrára utalva megjegyezzük, hogy ezen az ábrán vázlatosan szemléltetjük a találmány szerinti eljárás egy kiviteli módját, olyan rekombináns DNS-molekulák elegyének az előállítására, amelyek némelyike a je13 8 len találmányt jellemző beiktatott DNS-szekvenciákat tartalmaz. Humán fibroblaszt-interferon messenger RNS-t (IFN-ß mRNS) tartalmazó poli(A)RNS előállítása A találmány szerinti eljárásban alkalmazott RNS-t humán VGS-sejtekből vontuk ki; ez egy olyan diploid humán fibroblaszt sejtvonal, amely egyréteg-kultúrákban, 37°C hőmérsékleten szaporítható (A. Billian és munkatársai, J. Gen. Virol. 19, 1—8 /1973/). A humán ß-interferon ezekben a sejtekben poli (I,C)-vel történő indukció hatására, cikloheximid jelenlétében termelhető. Tipikus RNS-izolálás céljára 20 görgő-palackban konfluens egysejt-réteg alakjában elhelyezett diploid VGS-sejteket alkalmaztunk; a palackok mindegyikét éjszakán át 100 egység/ml ß-interferon „pnmeltük" és valamennyi kultúrát 1 órán át indukáltuk 100 pg/ml poli(I,C)-vel és 50 pg/ml cikloheximiddel, majd 4 óra hosszat inkubáltuk őket 50 pg/ml cikloheximiddel; a kapott kultúrát foszfát-pufferes sóoldatba kapartuk és lefontuk. A sejteket 0°C hőmérsékleten 15 percig lizáltuk a DNS-t tartalmazó intakt magok eltávolítása és a citoplazmás RNS izolálása végett; a lizálás oly módon történt, hogy a sejteket 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH=7,4), 10 mmól/1 nátrium-kloridot és 1,5 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó hipotóniás pufferoldatban szuszpendáltuk és NP40-et (kereskedelemben hozzáférhető, a DNS- és RNS-technikában ismert oldószer [C. Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982]) adtunk hozzá 1% koncentrációig. A sejtmagokat egy Sorvall SS-34 rotorban 3000 percenkénti fordulattal 5 percig történő centrifugálással pelletizáltuk és ily módon távolítotfuk el őket. A szupernatánshoz nátrium-dodecil-szulfátot és etilén-diamin-tetraecetsavat adtunk 1 %, illetőleg 10 mmól/1 koncentrációig, majd az elegyet ötször extraháltuk frissen desztillált fenol és 25:1 arányú kloroform-izoaminalkohol-elegy 1:1 arányú elegyének kétszeres térfogatával; az RNS- t tartalmazó vizes fázisokat mindegyik extrakció után egy Sorvall SS-34 rotorban percenként 8000 fordulattal történő centrifugálással különítettük el. Az RNS-t az elkülönített vizes fázisból 1/10 térfogat 2 mólos nátrium-acetát-oldat (pH=5,l) és 2,5 térfogat etanol hozzáadása útján választottuk le. Egy-egy görgő-palackból rendszerint összesen 60—90pg citoplazmás RNS-t kaptunk. Alkalmaztunk más módszereket is a citoplazmás RNS extrahálására. így például a sejteket 0,2 molos trisz-HCl (pH=9,0), 50 mmol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 etilén-diamin-tetraecetsav és 0,5 % nátrium-dodecil-szulfát elegyében történő homogenizálás után teljesen lizáltuk, majd fenol-kloroform eleggyel a fent leírt módon extraháltuk őket [F. H. Reynolds és munkatársai: „Interferon Activity Produced by Translation of Human 14 5 1C 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
