193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 Ilyen célra különböző expressziós kontroli-szekvenciák alkalmazhatók a fent leírt módon. Ezek sorába az E. coli laktóz-operonjának operátor, promoter, riboszóma-megkötő és interakciós szekvenciái (a „lac rendszer") tartoznak (beleértve az olyan szekvenciákat is, mint a Shine-Dalgarno szekvenciák), továbbá az E. coli triptofán-szintetáz-rendszerének (a „trp rendszer”) megfelelő szekvenciái, a L-fág nagyobb operátor- és promotor-tartományai (OJL amint fentebb leírtuk és 0^ ), az egyszálas filament DNS-fág kontroli-tartománya, valamint más olyan szekvenciák, amelyek szabályozzák a prokariotikus és eukariotikus sejtek és vírusaik génjeinek expresszióját. Ezért annak érdekében, hogy valamely adott polipeptidnek egy megfelelő gazdában történő termelését fokozzuk, a fentebb leírt módon előállíthatjuk az e polipeptidre kódoló gént és ezt egy rekombináns DNS-molekulából eltávolítva közelebb vihetjük előző expressziós kontroli-szekvenciájához vagy a fentebb említett expressziós kontroli-szekvenciák valamelyikének szabályozása alá vihetjük. A szakmában ismeretesek az e célok elérésére alkalmas módszerek. A transzláció hatásfokának javítására alkalmazható egyéb módszerek esetében kémiailag vagy enzimatikus úton előállított öli - gonukleotidokat iktatnak be az iniciáló kodon elé. Ezzel az eljárással a messenger RNS optimálisabb primer és szekunder szerkezete alakítható ki. Közelebbről megjelölve, a szekvencia oly módon szerkeszthető meg, hogy az iniciáló AUG kodon könnyen hozzáférhető helyzetben álljon (tehát szekunder szerkezet ne takarja el) akár egy „hajtű” tetején, akár valamely más egyszálas tartományban. Hasonló módon optimalizálható a fentebb említett Shine-Dalgarno szegmens helyzete és szekvenciája is. A messenger RNS általános szerkezetének fontosságára már rámutattak [D. Iserentant és W. Fiers: „Secondary Structure of mRNA and Efficiency of Translation Initiation”, Gene 9, 1 —12 (1980)]. A kívánt termékek sejt-hozamának további növelése ama gének számának növelésétől függ, amelyek hasznosíthatók a sejtben. Ezt oly módon érhetjük el, hogy HuIFN-ß-gént (transzkripciós és transzlációs kontroll-elemeivel vagy anélkül) iktattunk be egy még nagyobb kópia-számú plazmidba vagy egy hőmérséklettel szabályozott kópia-számú plazmidba (vagyis egy olyan plazmidba, amely oly értelmű mutációt hordoz, hogy a plazmid kópia-száma megnövekszik a hőmérséklet emelése után) [vö.: B. Uhlin és munkatársai: „Plasmids with Temperature-dependent Copy Number for Amplification of Cloned Genes and Their Products”, Gene 6, 91 —106 (1979)]. Elérhető a gén-adag megnövelése oly módon is, hogy például a fentebb leírt módon megszerkesztett rekombináns DNS-molekulákat bevisszük a temperált Vbakteriofágba, ami legegyszerűbben úgy érhető el, hogy a plazmidot egy resztrikciós enzimmel 36 69 kezeljük, hogy így egy lineáris molekulát kapjunk, amelyet azután egy resztringált Á-fágot klónozó hordozóval keverünk össze [ilyen típusú hordozót például N. E. Murray és munkatársai írtak le: „Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in Vitro Recombinants”, Mol. Gen. Genet., 150, 53-—61 (1977); N. E. Murray és munkatársai: „Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4", J. Mol. Biol, 132, 493—505 (1979)] és a DNS-ligázzal történő inkubálás útján kapott rekombináns DNS-molekulával. A kívánt rekombináns fágot azután a fentebb léírt módon különítjük el és alkalmazzuk egy E. coli gazda-törzs lizogénezésére. Az ilyen célra különösen alkalmas k klónozó-hordozók hőmérsékletre érzékeny mutációt tartalmaznak a cJL repressziós génben, továbbá szupprimálható mutációkat az Szénben; ezek terméke szükséges a gazdasejt líziséhez, tartalmazzák továbbá az E, gént, amelynek terméke a vírus nagyobb kapszid-fehérjéje. Ezzel a rendszerrel a lizogén sejteket viszonylag alacsony hőmérsékleten (például 28°C és 32°C között) szaporítjuk, majd magasabb hőmérsékletre (például 40-45°C- ra) melegítjük őket, a profág exciziójának indukálása céljából. A magasabb hőmérsékleten történő huzamosabb tenyésztés a fehérje nagy mennyiségekben való termelésére indít, ez a fehérje a sejtek belsejében marad, mert a fág gén termékek nem lizálják a sejteket a normális úton, és minthogy a fág gén betét nem kerül burokba, hozzáférhető marad a további transzkripció céljaira. A sejtek mesterséges lízise azután nagy hozammal szabadítja fel a kívánt terméket. Minthogy ebben az eljárásban a k represzszor-rendszert az expresszió szabályozására is felhasználtuk, szükségessé válhat a profág exciziójának és ennélfogva a gén kópia-számának a szabályozása egy például a lambdoid 21 fágból származó heteroimmun szabályozó tartomány útján. Megjegyzendő, hogy IFN-ß-aktivitäst mutató polipeptidek (a jelen találmánnyal összhangban) előállíthatok összekapcsolt (például egy az exkréciót irányító prokariota N-terminális szegmenshez kapcsolt) fehérje alakjában, vagy prointerferon (például az interferon szignál-szekvenciájával — amely az exkréció során lehasítható — kezdődően), vagy pedig érett interferon (ez utóbbi lehetséges, mert az érett interferon metioninnal, tehát egy a transzláció megindítására alkalmas aminosavval kezdődik) alakjában is. A polipeptid e különböző alakjainak hozama növelhető a fentebb ismertetett eljárások bármelyike vagy azok valamilyen kombinációja útján. A jelen DNS-szekvenciákban alkalmazott kodonok közül néhány vagy valamenynyi is kicserélhető más kodonokra. Ezek a behelyettesített kodonok ugyanazokra az aminosavakra kódolnak, mint azok, amelyek helyébe léptek, de nagyobb hozammal adhatják a polipeptidet. Lehetséges azonban az is, hogy 70 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
