193406. lajstromszámú szabadalom • Eljárás affinitás-szorbensek előállítására
5 193406 6 A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Amennyiben az aminosavak konfigurációját külön nem közöljük, azok természetes (L) konfigurációjúak. A végtermékeket a felhasznált polimerre vonatkoztatva 100%-os kitermeléssel kapjuk. Minthogy az immobilizálandó vegyületet mindig igen nagy (8-10 szeres) feleslegben használjuk fel, a végtermék hozama a bevitt immobilizálandó vegyületre vonatkoztatva körülbelül 10-12%. Az immobilizált biológiailag aktív vegyület koncentrációját a hordozón — ami az affinitás-szorbens jellemző minőségi adata — a példákban közöljük. 1. példa 25 ml OH-agaróz-OSu-t 50 ml olyan 0,1 mólos foszfátpufferben (pH=6,8) szuszpendálunk, amely milliliterenként 1 mg e-amino-BOC-lizint (H-Lys (BOC)-OH) tartalmaz. A szuszpenziót 3 órán át rázzuk, majd tízszeres térfogatú 2:2:1 térfogatarányú aceton — dimetii-formamid — víz eleggyel mossuk. A gélt elkülönítjük, térfogatával azonos mennyiségű 2:1:2 térfogatarányú dimetii-formamid— víz — aceton eleggyel ötször, majd desztillált vízzel ötször mossuk, ezután a következőképpen vízmentesítjük: 1 térfogatrész gélt 2-2 térfogatrész, növekvő mennyiségű (5, 10, 20, 40, 60, 80 térfogat%) acetont tartalmazó vizes acetonnal, vízmentes acetonnal, növekvő mennyiségű (5, 10, 20,40, 60, 80 térfogat%i) diklór-metánt tartalmazó diklór-metán — aceton eleggyel, végül vízmentes diklór-metánnal mossuk. Az oldószert vízsugár-vákuumban leszívatjuk, a gélt vele azonos térfogatú, 0°C-ra hűtött, 1:1 térfogatarányú trifluor-ecetsav-diklór-metán elegy#hen szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 2 órán át gyengén rázzuk. 2 óra elteltével a gélt leszűrjük, és vízmentes diklór-metánnal kétszer, csökkenő mennyiségű (95, 80, 60, 40, 20, 10, 5 térfogat%) diklór-metánt tartalmazó diklór-metán — aceton elegyekkel egyszer-egyszer, végül vízmentes acetonnal kétszer mossuk. A mosáshoz minden esetben a géllel azonos térfogatú mosófolyadékot használunk. Ezután a gélt oly módon rehidratáljuk, hogy csökkenő mennyiségű (95, 80, 60, 40, 20, 10, 5 térfogat%) acetont tartalmazó vizes acetonnal egyszer-egyszer, végül desztillált vízzel kétszer mossuk. A mosáshoz ekkor is a géllel azonos térfogatú mosófolyadékot használunk. Ezután a gélt térfogatának ötszörösét kitevő menynyiségü 0,1 mólos acetát-pufferrel (pH=4,75) mossuk, amely 0,02% nátrium-nitritet és antioxidánsként 0,1% L-aszkorbinsavat is tartalmaz. A gélt ugyanebben az összetételű pufferoldatban -(-4°C-on, fénytől védve tároljuk. A polimer hordozóhoz kötött lizin mennyiségét merkapto-etán-szulfonsavas hidrolízis után automata aminosav-analízissel határozzuk meg. A lizin koncentrációja a hordozón 3 x 10'3 mól/liter. 4 2. példa Az 1. példában leírtak szerint járunk el, de a-amino-BOC-lizint (BOC-Lys-OH) használunk fel. A polimer hordozóhoz kötött lizin mennyiségét az I. példában közöltek szerint határozzuk meg. A lizin koncentrációja a hordozón 2,5 x 1 CT3 mól/liter. 3. példa Az 1. példában leírtak szerint járunk el, de H-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2-t 'használunk fel. 4. példa 0,5 g vízmentes Akrilex C 100 pentaklór-fenil-észtert 10 ml vízmentes dimetil-formamidban szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 1 ml vízmentes piridint, majd 10 ml vízmentes dimetil-formamidban oldott 20 mg H-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2-t adunk, és a szuszpenziót 1 napig szobahőmérsékleten rázzuk. Ezután az oldószert vízsugárvákuumban leszívatjuk, és a gélt ötször 20 ml vízmentes dimetil-formamiddal és ötször 50 ml vízmentes acetonnal mossuk. Ezután a gélt diklór-metánnal mossuk, majd 1:1 térfogatarányú diklór-metán — trifluor-ecetsav elegyet adunk hozzá, és a szuszpenziót 1 órán át rázzuk. A gélt elkülönítjük, metanollal, dimetil-formamiddal és acetonnal mossuk, és xerogél formájában tároljuk. SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás az (I) általános képletű affinitás-szorbensek előállítására P - A - CO - NH - B (I) — a képletben P 10 000 és 100 000 közötti polimerizációfokú, affinitáskromatográfiai célokra alkalmas poliszacharid-lípusú hordozót, célszerűen agarózt vagy cellulózt, vagy akril-amid telítetlen karbonsavval képezett, divinil-vegyülettel térhálósított, 10 000 és 100 000 közötti polimerizációfokú kopolimerjét jelenti az -A-COOH oldallánc nélkül, A -(CH2)„- csoportot jelent, ahol n értéke 1 és 10 közötti egész szám, és B egy aminosav, polipeptid vagy neurotranszmitter-karbonsav maradékát jelenti az -NH2 végcsoport nélkül —, azzal jellemezve, hogy (II) általános képletű polimer hordozóhoz P - A - COOH (II) — a képletben P és A jelentése a fenti — aktív észter-módszerrel egy (III) általános képletű aminosav, polipeptid vagy neurotranszmitter-karbonsav B - NH2 (III) — a képletben B jelentése a fenti — olyan védett származékát kapcsoljuk, amely az összes jelenlévő aminocsoportot (a terminális aminocsoport kivételével) és adott esetben a jelenlévő heterociklusos amino-, hidroxil- és/vagy karboxilcsoporto(ka)t is savval lehasítható védőcsoporttal védett állapotban tartalmazza, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
