193374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozó-ligandum-komplexek előállítására
193374 1 A találmány tárgya eljárás hordozó-ligandum-komplex előállítására nukleofil komponenseknek aktivált polimer hordozókkal történő átalakításával. Alkalmazási területe a biotechnológia, a vegyipar és a gyógyszeripar. Egyre szélesebb körben alkalmazzák a hordozón rögzített reagenseket az anyagátalakulási folyamatokban vagy az analitikai preparatív anyagelválasztásokban (A. Wisemann (Edtr.) Handbook of Enzyme Chemistry, New York 1975, D. R. Lowe, An Introduction to Affinity Chromatography, Amsterdam 1979). A hordozóra kötött rendszer olyan polimer mátrixból, hordozóból áll, amelyen kovalens adszorpciós kötéssel rögzítik a kívánt specifikus hatású anyagokat (ligandumokat). Ligandumként természetes vagy szintetikus, bizonyos kémiai vagy biológiai hatással rendelkező vegyületeket alkalmaznak, így például anyagátalakulásoknál katalizátorként enzimeket, proteineket és lektin hatású peptideket, inhibitorokat, antigéneket vagy antitesteket, nukleinsavakat, poliszacharido'kat, cukorszármazékokat. A ligandumok megkötésére alkalmazott polimerek egyrészt természetes poliszacharidok, ilyenek például a cellulózok, a keményítők, a dextránok, az agarózok és ezek származékai vagy a szintetikus hidroxilcsoportot tartalmazó polimerek, a hidrofil vinil-polimerek (fraktogél, TIK) vagy a fenol-formaldehid-kondenzátumok (duolit), valamint az aminocsoportot tartalmazó polimerek, így a poli(akril-amid), a módosított poliszacharidok (így az amino-hexil-szacharóz) vagy a proteinek is. A hordozók és a ligandumok közötti kovalens kötések kapcsolódása jelentősen befolyásolja a keletkező termék tulajdonságait, és így állandóan az újabb kutatások tárgyát képezi. A peptidszerű ligandumok kötése leggyakrabban az a- és az e-aminocsoportokon keresztül történik, habár lehetőség van a karboxilcsoporton vagy az SH-csoporton keresztül lezajló reakcióra is. A ligandumok kötődésének alapvető feltétele, a hordozó kémiailag kevésbé reakcióképes hidroxilcsoportjának az aktiválása. A polimer hordozón található különbö ző ligandumok immobilizálására alkalmazható módszerekről áttekintést nyújtanak a következő munkák és monográfiák: Chemi cal Analysis, 59, P. J. Elving, J. D. Wineford ner (Edtrs.), New York 1981; E. A. Hill, M. D Hirtenstein, in Advances in Biotechnologica' Processes 1, 31—66., New York, 1983). A találmány tárgyalásához csupán olyar kapcsolódási reakciókat említünk meg, amelyeknél stabil, aktivált hordozót alkalmaz nak, azaz az aktivált észterek spontán reak dóit, így az N-hidroxi-szukcinimid-észter ((A) reakcióvázlat] vagy az epoxid-csoportot 2 2 tartalmazó hordozó [(B) reakcióvázlat] nukleofil ligandummal történő kapcsolódását, amely az „A" és a „B" reakcióvázlat szerint történik. 5 Néhány N-hidroxi-szukcinimid-észtert és epoxicsoportot tartalmazó hordozó kereskedelemben is kapható, és ezeket már széles körben is alkalmazzák. Ezeknek az említett aktivált hordozóknak az előnye, hogy hosz- 10 szabb ideig eltarthatok, és ezáltal könnyen kezelhetők. A hordozóra kötött rendszer előállításakor elmarad a többi módszernél szükséges mátrix-aktiválás, valamint nem kell erősen toxikus anyagokkal és csekély stabi- 15 litású aktivált közbenső termékekkel dolgozni. Ez a hordozó kiemelkedik azáltal is, hogy a hordozó és a ligandumok között létesített kémiai kötés nagyon stabil, amely meghatározza a hordozóra kötött rendszer minősé- 20 gét. Az epoxi-aktivált hordozók adagolását jelentősen korlátozza a kötéshez szükséges magas pH-érték. Alkáli érzékeny enzimeket és proteineket, valamint redukáló csoporto- 25 kát tartalmazó szacharidokat csak a kémiai kötés létrehozásához szükséges pH-értéknek és hőmérsékletnek szabad kitenni. Ezzel szemben az N-hidroxi-szukcinimid-észter — vagy a klór - hangyasav-észter ak- 30 tivált hordozó 6—9-es pH-értéknél, nagyon kímélő körülmények között alakítható át. A ligandum kötésének kialakításához az N-hidroxi-szukcinimid-észter alkalmazásakor jelentős kritérium a hidrolízissel szemben tapasz- 35 talt csekély ellenállóképessége. A hidrolízissel keletkező karboxilcsoportok nagymértékben befolyásolják a 7,0-nál kisebb izoelektromos ponttal rendelkező proteinek kötését. Nagymértékben kompenzálhatjuk a ke- 40 letkező negatív töltést, ha az aktivált észtermolekula hézagába pozitív töltésű csoportot viszünk. Mégis, az ilyen jellegű termékeknél erősen lecsökken a bázisos proteinekhez kötődés. Az N-hidroxi-szukcinimid-észterek 45 hidrolízissel szembeni érzékenysége miatt a hordozó korlátozottan alkalmazható proteinek kapcsolódására és erősen lecsökken a ligandumokat tartalmazó hordozóknak, a bevezetet funkcionális csoportok számával elér- 50 hető töltése. A találmány célja stabil hordozó-ligandum-komplex előállítása. A találmány alapja egyszerű eljárás stabil hordozó-ligandum komplex előállítására. 55 A feladatot úgy oldottuk meg, hogy aktivált hordozóra a nukleofil ligandumot kovalens kötéssel kapcsoltuk, amikor is a hordozó hidroxilcsoportját (I) képletü N-(klór-karbonil -oxi)-5-norbornén-2,3-dikarboximiddel akti - 50 váltuk. Az (I) képletű N-(k'ór-karbonil-oxil-5-norbornén-2,3-dikarboximid új vegyület,és előállítása úgy történik, hogy foszgént N - -hidroxi-5-norbornén - 2,3 - dikarboximiddel (HONB) — előnyösen tercier amin jelenlété- 65 ben — vagy a HONB nátriumsójával (NaONB) átalakítjuk.
