193373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos 9'-tiapeptid-ergotalkaloidok előállítására
193373 4 táptalaj, 18 mm átmérőjű és 20 cm hosszú kémcsőben ékszerűen kialakulva). Egy ilyen ferdecsöves agartenyészetből a csírákat steril vízben felszuszpendáljuk úgy, hogy a szuszpenzió egymillió — tízmillió csíra/ml koncentrációjú legyen. Az előbbi táptalajú ferdecsöves agarokat az így kapott szuszpenzió 0,5—0,5 ml-ével egyenletesen beoltjuk. Ezeket a tenyészeteket 24°C-on 14 napon át inkubáljuk. Ezután a tenyészeteket —40°C-on tároljuk, b./ NRRL 12044 Az NRRL 12044 jelű törzs szaporítása és ebből oltóanyag előállítása úgy történhet, hogy a fent leírt tenyészetből a csírákat steril vízben felszuszpendáljuk, és a fent leírt táptalajú ferdecsöves agarokat ezzel beoltjuk. 18 nap múlva egy ilyen ferdecsöves agartenyészet körülbelül egy — két milliárd csírát tartalmaz (12 ml táptalaj, 18 mm átmérőjű és 20 cm hosszú kémcsőben ékszerűen kialakulva) . Egy ilyen ferdecsöves agartenyészetből a csírákat steril vízben felszuszpendáljuk úgy, hogy a szuszpenzió egymillió — tíz - millió csíra/ml koncentrációjú legyen. Az előbbi táptalajú ferdecsöves agarokat az így kapott szuszpenzió 0,5—0,5 ml-ével egyenletesen beoltjuk. Ezeket a tenyészeteket 24°C-on 14 napon át inkubáljuk. Ezután a tenyészeteket —40°C-on tároljuk. Előtenyészetek A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél előnyösnek bizonyult a csírákat előbb előfokozat/ok/on át elszaporítani, mielőtt ezekkel a termőtáptalajt beoltanánk. Először is olyan táptalajt kell választani, ami a jó szaporodási képességet és a gyors micéliumnövekedést biztosítja. Az ilyen táptalaj a következőket tartalmazza: szénforrást, bőséges mennyiségben, mono- vagy diszacharid formájában, adott esetben polialkoholokkal való kombinációban, nitrogénforrást aminosav vagy ammóniumsó formájában, továbbá ásványi sókat, nyomelemeket és növényi magvakból nyert bioszanyagokat. Előnyös a pH-t 5 és 7 közé beállítani. Az első lépésben a táptalajt a csírákkal bőségesen beoltjuk, és rázógépen vagy különböző méretű fermentorokban 22—26°C-on, 4—7 napig inkubáljuk. így sűrű tenyészet keletkezik a laza, vattaszerű, 2—3 mm átmérőjű, nem pigmentált micéliumpelyhekből, amik 3—6 p átmérőjű, hosszú hifafonalakból állnak. Főtenyészetek Az egy vagy adott esetben több előfokozatban kapott tenyészet egy részével beoltjuk a termőtáptalajt, ami előnyösen olyan összetételű, hogy rövid idő alatt nagy micéliumtömeg szaporodik el benne. A legjobb és legolcsóbb szénforrásnak a szacharóz bizonyult, nitrogénforrásnak az ammóniumsók, így az ammónium-oxalát, -citrát, -szukcinát és a -formiát. Ezenkívül ásványi sóknak és nyomelemként vasnak és cinknek is kell lennie a táptalajban. A tenyésztést vagy Erlen-3 meyer lombikban, vagy különböző nagyságú fermentorokban hajtjuk végre. Fontos a jó levegőztetés. Az optimális hőmérséklet 24°C. Az alkaloidatermelés kezdetén, normálisan a 3.—6. napon a főtenyészethez adunk literenként 1—5 g L-tiazolidin-4-karbonsavat, vagy ennek a savnak a sóját, így például a kálium-, nátrium- vagy az ammonium sóját. Ezután a tenyészeteket további 6—12 napon át inkubáljuk. A 9.—18. nap folyamán sűrű tenyészet képződik, ami finom pelyhek mellett főleg 0,5—3 mm hosszú és 0,1 — 1 mm vastag hengeres kompakt micéliumrészekből áll. A micéliumdarabok szerkezetükben plektenchimatikus szövet képét mutatják, gömb vagy poliéderes — alacsony hengeres alakú, erős falú, sok vakuolummal ellátott sejtekből, amik 6—12 x 6—14 p, főleg 8 x 9 p méretűek, és amik 100 p-ig terjedő hosszúságú hifafonalakkal vannak átszőve. A sejtek barnásán pigmentáltak. A tenyészet szűriete szintén barnás színű. Amikor a micéliumtömeg súlya és alkaloidtartalma már csökken, az alkaloidot szerves oldószerekkel nyerhetjük ki az egész tenyészetből, önmagában ismert extrakciós eljárásokkal, vagy a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk a szűrlettől, és a két részt külön extraháljuk. A peptidalkaloidok főrésze a micéliumokban halmozódik fel. Az (I) általános képletű vegyületek elkülönítése Ezeket a kéntartalmú ergotalkaloidokat a tenyészetből, a tenyészet szűrletéből vagy a micéliumtömegből különíthetjük el ismert extrakciós eljárások segítségével. A vegyületek tisztítása a szokásos tisztítási fokozatokon keresztül történik, így például aktív oldószerekből inaktív oldószerekkel való kicsapással, vagy nehezen oldható sókká való átalakítással. Különösen alkalmasak az ismert tisztítási eljárás'ok, így például az alumínium-oxidon, kieselgélen, Sephadex LH-20-on stb. való kromatográfiás eljárások, a mindenkor megfelelő oldószerrendszerekben. Miként az ismert ergotalkaloidok, úgy ezek az új 9’-tiapeptid-ergotalka!oidok is érzékenyek a napfényre. Szabad formájukban és poláros oldószerekkel készült oldataikban egy bizonyos egyensúlyi helyzetig, a mindig meglévő másik formává izomerizálódnak. Sók, így például a metánszulfonsavval képzett sók formájában a 9’-tia-ergotamin és a 9’-tia-ergokrisztin hosszabb időn át stabil. A találmány szerinti új vegyületek a szakirodalomban eddig még ismeretlenek. Ezeknek a vegyületeknek állatkísérletekben érdekes farmakológiai tulajdonságaik vannak, és ezért gyógyszerként alkalmazhatók. Ezeknek a vegyületeknek különösen a dopaminreceptorokat stimuláló hatása van. A dopaminerg tulajdonságot 0,5—100 mg/kg dózisban olyan patkányokon állapítottuk meg, amelyeknél a feketeállományba (Substantia 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
