193151. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
193151 Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a gangliozidok belső észter-származékaival igen hatékonyan kezelhetők az idegrendszer zavarai, és lényegesen nagyobb az aktivitásuk, mint maguké a gangliozidoké. A gangliozidok belső észter-származékai felhasználhatók sokféle idegi rendellenesség kezelésére, például betegség vagy baleset folytán bekövetkező, perifériás és központi idegrendszeri zavarok gyógyítására. A vegyületek sebészeti beavatkozás utáni terápiához is felhasználhatók, ha a műtét az idegeket is érinti, például aranyér operációk után. A találmány szerint előállított gangliozid belső észter-származékok kiemelkedő farmakológiái tulajdonságait az alábbi teszteken mutathatjuk be a gangliozidokkal összehasonlítva: 1. Neurit sarjadzás; phaeochromocytoma sejtvonalon (PC12). 2. Neuron membrán (Na+K+)ATPase enzim aktivitása. 3. Az elektroretinogramm eredeti értékének visszaállása elvakítás után. 1. Gangliozidok belső észter-származékainak hatása PC12 sejtvonai neurit sarjadzására A szükséges anyagok és az alkalmazott módszerek A neurit sarjadzás lokalizált neuron-differenciálódásnak tekinthető, és az a biokémiai mechanizmus, amellyel a gangliozid molekulák létrehozzák a fenti hatást, in vitro sejttenyészet modellen tanulmányozható. Ez az 1A alklónból eredő PC12 sejtvonal, amelyet dr. P. Calissano (C.N.R. Laboratorio di Biológia Cellulare, Róma, Olaszország) bocsájtott a rendelkezésünkre. [Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair, kiadó M. M. Rap-I. táblázat 11 port és A. Gorio, Raven Press, New York, 1931], E modell értelmében a gangliozidokat vagy a gangliozidok belső észter-származékait hozzáadjuk a PC[2 tenyészetet tartalmazó táptalajhoz idegsejt növekedési faktorral (NGF) együtt, amely specifikus módon indukálja a PC12 sejtvonal differenciálódását, és ezáltal serkenti a neurit sarjadzást. A gangliozidokkal serkentett neurit sarjadzást ekkor összehasonlíthatjuk a gangliozidok belső észterszármazékaival serkentett sarjadzással, A sejteket (lemezenként 100 000 darab) 37 °C-on tartottuk Heraeus inkubátorban (5% szén-dioxid és 95% nedvesített levegő), majd átvittük kollagénnel bevont szövettenyészetre (60 mm Integrid Falcon lemezek) a következő táptalaj jelenlétében: 85% RPM 1640 (Gibco), 10% hőhatással inaktivált lószérum (Gibco), 5% magzati borjúszérum (Gibco), 50 egység/ml penicillin és 25 mg/ml sztreptomicin. A táptalajt 48 óránként cseréltük. Ilyen körülmények között a sejtek osztódnak ugyan, neuritokat azonban nem képeznek. 50 ng/ml mennyiségű idegsejt növekedési faktor hozzáadására a sejtek burjánzása abbamarad, 5—10 napon belül neuritokat képeznek és differenciálódnak. Ezt a hatást úgy értékeltük ki, hogy az 5. naptól kezdve kétnaposként megszámoltuk a neuritokat tartalmazó sejteket. A gangliozidokat, illetve származékaikat az idegsejt növekedési faktorral egyidejűleg adtuk hozzá 1 mM mennyiségben a táptalajhoz. Hatásukat a 7. és a 9. napon értékeltük ki, megszámolva a neuritokat tartalmazó sejteket. Eredmények A neurit sarjadzással kapcsolatban végzett összehasonlító vizsgálatok eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 Gangliozid-származékok hatása a neurit sariadzásra PCj£ sejteken Vegyület Sejtvonal Táptalaj Koncent- Neuritokat tarráció talmazó sejtek száma, % 7.napon 9.napon Kontroll PC* 85% RPM 164C, 10% hevítéssel inaktivált lószérum, 5% magzati borjúszérum, 50 egység/ml penicillin és 25 mg/ml sztreptomicin 31 35,7 Gangliozidok pc,e It 1 mM 49,5 62,3 Gangliozidok belső,észterei PC lg It ! mM 56,3 69,2 7
