193150. lajstromszámú szabadalom • Hibridvektor és eljárás hibridvektorok sokszorozódásának és működésének a javítására mitokondriális DNS alkalmazásával
193150 Sal 1 (Streptomyces albus-bói nyert), Kpn 1 (Klebsiella pneumoniae-böl nyert) és Bgl II (Bacillus globigii-ből nyert) restrikciós enzimmel végzett emésztés útján a íentemlített oligomer DNS-t teljes mennyiségében a 0,75 pm hosszúságú DNS-szegmensekre bonthatjuk. 2. A hibridvektor előállítása Az E. coliban,, Podospora-ban egyaránt klónozható vektornak az E. coli pBr 322 jelű plazmidja és az elkülönített pl-DNS összekapcsolásával történő előállítása, az irodalomból (Stahl et al., »Molec. gen. Genet.«, 178, 639—646 /1980/) már ismert. Az ilyen jellegű hibridvektornak az E coli pBr 322 jelű plazmidja és a mitokondriális DNS replikációs ponttal rendelkező, a Pl-DNS-sel részben analóg, replikációs frag mensének (Sál 4 jelű fragmensének) összekapcsolása útján történő előállítása azonban új. A hibridvektor az alábbiak szerint állítható elő: A pl-DNS azért használható vektorok szer kesztéséhez, mert replikációs ponttal rendelkezik. Ebből következik, hogy a vektornak a Podospora ép (juvenilis) mitokondriális DNS-éből kiinduló felépítése csak akkor lehet sikeres, ha a DNS-ből kivett fragmens szintén replikációs ponttal rendelkezik. A juvenilis milokondriálisDNS ilyen fragmensc a Sal I jelű restrikciós enzimmel végzett kezelés útján nyerhető. Tehát a pBr 322 jelű plazmidot és a Podospora anserina tisztított, juvenilis, mitokondriális DNS-ét a Sal I jelű restrikciós enzimmel feldaraboljuk, és a kapott töredékeket ligázzal összenövesztjük (a módszer Stahl fentebb idézeti publikációjában található). A kapott hibridvektort ampicillinnel szemben rezisztens, transzformált E. coli-ban szelekciónak vetjük alá. Az E. coli sejtek DNS-ét elkülönítjük és restrikciós elemzéssel azonosítjuk; így azokat a hibridplazmidokat választhatjuk ki, amelyek az átviendő DNS-fragmenst, jelen esetben a Sál 4 jelű fragmenst tényleg befogadták. Az ezt a fragmenst tartalmazó hibridvektorok Podospora-ban ugyanolyan jó transzformációt és replikációt mutatják, mint a pBr 322 plazmidból és pl-DNS-ből már korábban előállított hibridvektorok. A találmány szerinti eljárás tetszés szerinti mitokondriális DNS-ek esetében univerzálisan alkalmazható; ennek egyetlen feltétele, hogy a replikációs pont ismert kell, hogy legyen. 3. Podospora transzformálása hibridvektorokkal a) Befogadó törzsek Az alábbi eljárás elvben a Podospora anserina vad törzseivel is végrehajtható; ez 5 4 esetben a bejuttatott hibridplazmid jelenléte öregedési folyamatok kiváltásában nyilvánul meg. A gyakorlati alkalmazás szempontjából ez azonban eléggé kedvezőtlen, mert az így transzformált törzsek gyorsan és irreverzibilisen elpusztulnak. Hosszúéletű Podospora-mutánstörzsek alkalmazásával ez a probléma megoldható. Eddig az alábbi két törzset alkalmazták: — a Podospora gr viv (grisea/vivax) nevű kettős mutáns, amelynek a morfológiáját Tudzynski és Esser (Molec. gen. Genet. 173, 71—84 /1979/) írta le. A DMS 2099 szám alatt letétbe helyezett mutáns nem mutat öregedési jelenségeket, és szabad pl-DNS-t nem tartalmaz. A mutáns azonban pl-DNS-el és hibridvektorokkal transzformálható, és utána az elöregedés jeleit mutatja. Ezek a jelek nem domborulnak ki annyira, mint a vad törzs esetén, emellett lehűtéssel részben reverzibilissé tehetők. — A Podospora i viv (incoloris vivax) nevű kettős mutáns, amelynek a morfológiáját Esser és Keller (Molec. gen. Genet. 144, 107—110 /1976/) írta le. A DSM 2098 szám alatt letétbe helyezett törzs sem spontán, sem indukált öregedést nem mutat. Tekintettel arra, hogy a pl-DNS sokszorozódhat benne, a törzs befogadó törzsként kiválóan alkalmas. E törzs esetében az öregedés kiváltása természetesen nem alkalmazható a transzformált egyedek szelektálásának alapjaként. b) A transzformálás A befogadó törzset Fernbach féle lombikban teljes táptalajon 26°C-on 4—5 napon keresztül tenyésztjük. Az aratott micéliumot protoplasztok előállításához alkalmas puífer-oldatban szuszpendáljuk, mintegy 20 másodpercig homogenizáljuk, majd protoplasztok nyerése céljából 3 órán keresztül Trichoderma harziánum-ból származó lítikus emzimeleggyel kezeljük. A protoplasztokat az említett puffer-oldattal (0,1 moláris trisz-maleát-oldatot nátrium-hidroxiddal pH 7-re állítjuk és 0,5 mól szacharózt oldunk fel benne) kétszer mossuk. A fenti összetételű puffer-oldathoz 10 mmól kalcium-kloridot adunk, és az így módosított pufferben a protoplasztokat 5X106—5X107 koncentráció eléréséig újból szuszpendáljuk. A hibrid-DNS-t TES-pufferben (0,05 M Tris, 0,005 mól EDTA, 0,05 mól nátrium-klorid, pH8) felodjuk, mégpedig a vad törzs esetében 5—10 pg/ml koncentrációban, a mutált törzs (gr viv kettős mutáns) esetében 40 pg/ml koncentrációban. Ezt az oldatot a fenti protoplaszt-szuszpenzióhoz adjuk, ugyanakkor hibrid-DNS nélküli kontrollt is készítünk. Az elegyet 26°C-on 15 percen át állni hagyjuk, majd 1:10 arányban PEG-pufíerrel (20% polietilén-glikol 4000, 10 mmól kalcium-klorid, 10 mmól Tris-HCl, pH 7,5) 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
