193068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált kombinált galamb-vakcina előállítására
193068 2 1 A találmány tárgya eljárás inaktívált kombinált vakcina előállítására. A vakcina a galambok között leggyakrabban előforduló fertőzöttségek ellen nyújt védelmet. Galambokon végzett kórbonctani és szerológiai vizsgálatok bizonyították, hogy hazánkban a galambok között leggyakrabban négyféle fertőző betegség fordul elő, ezek: Salmonella typhi murium (paratífusz), Chlamydia psittaci (ornitozis),herpes vírus és Mycoplasma gallisepticum. A paratífusz fertőzöttség és a herpes vírus okozta fertőzöttség ellen már létezik vakcina, de a másik két betegséggel szemben még a világon nincs vakcina forgalomban. A találmány célja olyan kombinált inaktívált vakcina kidolgozása volt, amely mind a négy betegséggel szemben védelmet biztosít. Azt találtuk, hogy a fenti célnak megfelelő kombinált vakcinát az alábbi négy mikroorganizmus felhasználásával állíthatjuk elő: Salmonella typhi murium OKI 00275 Mycoplasma gallisepticum OKI 00276 Galamb herpes virus OKI 00247 Chlamydia psittaci OKI 00253 A Galamb-herpes vírus és a Chlamydia psittaci már szabadalmaztatott vakcinák gyártása során alkalmazott törzsek. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a négy betegséggel szemben hatékony vakcina előállításánál igen fontos a 4 különböző antigén megfelelő aránya. A találmány értelmében úgy járunk el,hogy a Salmonella typhi murium OKI 00275 jelű törzsét és a Mycoplasma gallisepticum OKI 00276 jelű törzsét megfelelő táptalajon, a Galamb-herpes vírus OKI 00247 jelű törzsét primer csirkeembrio-íibroblaszt sejttenyészeten és a Chlamydia psittaci OKI 00253 jelű törzsét előkeltetett tyúktojásban szaporítjuk, önmagában ismert módon inaktíváljuk és az inaktívált anyagok összekeverésével dózisonként 1,3-2 milliárd Salmonella egyedet, 2,5-3,5 milliárd Mycoplasma egyedet. a Chlamydia psittacit 107-107’5 EIDS0 (embrió iníektív dózisa) és a herpes vírust ÍOMO4’5 TCID50 (tissue culture (szövettenyészet) infektív dózis) mennyiségben tartalmazó vakcinát készítünk és a vakcinát kívánt esetben adjuváljuk. A Salmonellát előnyösen lósavós agar-tápközegen a Mycoplasmát előnyösen élesztődializátumot, glükózt és adott esetben lósavót tartalmazó tápközegen szaporítjuk; az említett táptalajok ásványi sókat is tartalmaznak a szokásos mennyiségben. A Herpes vírus legjobban primer csirkeembrió-fibroblaszt sejttenyészeten szaporítható. Chlamydia psittaci szaporításához 7 napos előkeltetett tyúktojásokat használhatunk fel. A vakcinát, hogy ne tartalmazzon élő mikroorganizmust, megfelelő módon inaktíválni kell. Mind a négy komponens inaktiválása formáimnál, ß-propiolaktonnal vagy etilén-2 iminnel elvégezhető. A legelőnyösebbnek az alábbi egymáshoz rendelést találtuk: Herpes vírus etilén-imin Mycoplasma gallisepticum formalin Chlamydia psittaci formalin Salmonella typhi murium formalin. A vakcina adjuválására előnyösen ásványi olajat vagy Al(OH)3-çélt alkalmazunk. A találmány szerint készített négykomponenses vakcina az eddig küiön-külön alkalmazott Herpes- és Chlamydia-vakcinákkal azonos vagy annál jobb immunitást eredményez, ugyanakkor két további gyakori íertőzöttség ellen is nyújt védelmet. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. 1. példa a) Herpes vírus Primer csirkeembrió-fibroblaszt (CEF) sejttenyészetet állítunk elő tripszínezéssel. A teljesen benőtt kultúrán szaporítjuk el a Herpes-vírust. Vakcinakészítésre csak az a vírusszuszpenzió alkalmas, amely a vírust legalább 104’2 TCID/0,1 ml koncentrációban tartalmazza. A vírust 500 pg/ml végkoncentrációig alkalmazott etilén-imiddel szobahőmérsékleten 24 órán át inaktíváljuk. b) Mycoplasma gallisepticum A Mycoplasmát BEG-tápközegben (bouillon élesztokivonattal és glükózzal) szaporítjuk. A tápközeget az alábbiak szerint készítjük. Alapoldat Heart infusion broth (DIFKO) 2,25 g desztillált víz 90 ml 0,1 n NaOH 0.7 ml Az alapoldatot autoklávban 115° C-on 20 percen sterilizáljuk. Utána az alapoldat 100 ml-jéhez a következő oldatokat adjuk: cen át inaktiválva) 20 ml 0,4%-os élesztőkivonat (DIFCO) 10 ml 10%-os talliumacetát-oldat 0,6 ml penicillinoldat (200 000 NE/ml) 0,25ml 10%-os glükózoldat 2 ml 0,2%-os DNS-oldat (csirke vörösvértestből készült; REANAL) 1,3 ml 0,06%-os íenolvörös-oldat 5 ml Az alapoldathoz adott oldatokat és a lóvérsavó előzőleg Seitz-szűrőn szűrjük. A tápközeg végső pH-ja 7,8. A fenti tápközegben a Mycoplasmát szaporítjuk 48-72 óráig. A Mycoplasma-szuszpenziót centrifugáljuk, az üledéket újból szuszpendáljuk.majd 0,2%-os formalinnal 37° C-on l napon át inaktíváljuk, c) Chlamydia psittaci A Chlamydia psittaci szaporításához 7 napos előkeltetett tyúktojásokat használunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
