193060. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-39079 antibiotikum S-1faktor előállítására
193060 térésű, 250/perc fordulatszámú körkörös rázógépen. 800 ml így előállított második-képcsős tenyészettel oltunk 100 liter, az A pontban ismertetett összetételű steril termelő-táptalajt. A beoltott termelő táptalajt 165 literes tank-fermentorban 5-7 napon át inkubáljuk 30° C-on.A fermentációs közeget steril levegővel levegőztetjük úgy, hogy az oldott-oxigén szintje 30-60% között legyen, és szokásos keverővei 200/perc fordulatszámmal kevertetjük. 2. Példa Az S-l faktor, kloramfenikol és cikloheximid kinyerése 100 liter az 1. példa B pontja szerint előállított fermentlevet szűrési segédanyaggal (Hyflo Supercel, Johns-Manville Corp) megszűrünk. A kapott 86 liter szfirlei pH-ját 5 normál sósavval 2,0-re állítjuk, majd kétszer 0,5 — 0,5 térfogat etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos kivonatot csökkentett nyomáson besűrítve 49 g olajos terméket kapunk.Ezt a maradékot metanolban oldjuk,majd 10 liter Diaion HP-20 oszlopra visszük (Mitsubishi Industries). Az oszlopot 500 ml vízzel mossuk, majd acetonitrihvlz eleggyel eluáljuk (30 liter 3:7 arányú, majd 50 liter 3:2 arányú eleggyel), utána 20 liter acetonitrillel. Az eluálást 100 ml/perc sebességgel végezzük, 4 literes frakciókat gyűjtünk.A frakciók antibiotikus aktivitását vizsgáljuk Micrococcus luteus, Escherichia coli és Neurospora crassa mikroorganizmusokkal szemben. A Neurospora crassa-ra ható cikloheximid a 3:7 frakciók elején eluálódik.Az Escherichia coli-ra ható kloramfenikol a késői 3:7 frakciókban eluálódik. A Micrococcus luteusra ható S-l faktor tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd csökkentett nyomáson besűrítve 7,65 g olajos maradékot kapunk. Ezt a maradékot 1,9 literes szilikagéloszlopon (grade 62, Matheson, Coleman és Bell) kromatografáljuk. Az oszlopot 2,5 liter 90:0,5 arányú kloroform :metanol:ammónium-hidr-1 oxid eleggyel eluáljuk 20 ml/perc sebességgel. A frakciókat a színük'alapján (sárga és vörös) valamint a Micrococcus luteus-szal szembeni aktivitásuk alapján egyesítjük.A vörös színű sávból származó frakciókat csökkentett nyomáson besűrítve olajszerfi anyagot kapunk.Az olajat 100 ml tetrahidrofuránban oldjuk, majd a terméket 15 térfogat hexánhoz adva kicsapjuk. A csapadékot elválasztva 1,2 g S-l faktort kapunk. Az S-l faktor további tisztítását 200 mg-os részletekben végezzük, metanolban oldva, majd 2,54 x 30 cm-es, Zorbax ODS (12p.) (E.I.duPont) töltetű oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 10 ml/perc sebességgel eluáljuk 400 ml 45% acetonitril-0,01% trifluor-ecetsav eleggyel, majd 400 ml, 0,01 % trifluor-ecetsavban készített 45-100%-os acetonitril gradienssel. A frakciókat UV ab szorpció (264 nm-en) és M.luteus-szal szembeni aktivitás alapján vizsgáljuk. A csak S-l faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, besűrítjük, majd liofilezzük. Az S-l faktoron kívül más anyagokat is tartalmazó frakciókat besűrítjük, majd preparatív HPLC oszlopon újra kromatografáljuk. Körülbelül 800 mg" tisztított S-l faktort kapunk 100 liter fermentléből,melynek fizikai állandóit a leírás bevezető része tartalmazza. SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás az (I) általános képletű A39079 S-l faktor redukált és oxidált alakjának előállítására, ahol R és R’ jelentése egyaránt vagy hidroxi-csoport vagy oxo-csoport, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces spheroides NRRL 15600 törzset, vagy annak A39079 S-l termelő variánsát vagy mutánsát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó tenyésztő közegben,sülylyesztett-levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük, a terméket izoláljuk, és kívánt esetben a keletkezett klóramfenikoltól, cikloheximidtől, aktifenoltól vagy szeptacidintől elválasztjuk az A39079 S-l antibiotikumot. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45
