193053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására
1 193053 2 Limfotoxin-mRNS termelésénél az előnyös találmány szerinti eljárás a következő: szérum tartalmú tápoldathoz, például RPMI 1640-hez 10% fetális borjúszérumot és 10-100 ng/ml TPA-t vagy mezerein-t adunk stimulátorként, s a transzformált sejteket ebben a tápoldatban inkubáljuk 6-48 órán át, előnyösen 12-24 órán át, végül a sejteket elválasztjuk, majd roncsoljuk és a mRNS-t ismert eljárással izoláljuk. A sejt-tenyészet termékeinek izolálásánál és az így kapott limfotoxin tisztításánál alkalmasnak mutatkozik a kontrollált pórusíi üvegdarán (pórus controlled glass = PCG) történő kromatografálás (először itt került alkalmazásra) ; a sejtmembrán roncsolása és a sejtmag eltávolítása után a limfotoxin-mRNS-nek például fenollal való extrahálása különösen alkalmasnak bizonyul. A limfotoxin további tisztítása például HPLC (high performance liguid chromatography) alkalmazásával történik. Az így kapott limfotoxin — molekulasúly 60.000±15% — például vizes izotoniás oldatban, profilaxis céljára és tumorsejtek ellen alkalmazható. A technika állásával szemben a találmány szerinti eljárás az alábbi előnyökkel rendelkezik: 1. Korlátlan élettartalmú, homogén sejt populációt alkalmaz, s a sejtek szaporítása tetszés szerinti méretekre növelhető; 2. Ezekben a tenyészetekben a limfotoxin termelés spontán történik, azaz nincs szükség nagymolekulájú mitogének adagolására; 3. A limfotoxin termelés alacsony molekulasúlyú stimulátorokkal tovább növelhető; 4. Szérummentes tápoldatban a limfotoxin termelés kihozatala magas, így kiváló Sejtvonal Eredet (transzformáló herpes vírus = HV) 1670 Saguinus oedipus egy tumoros állat lépe (HV saimiri) Irodalom: A= Fleckenstein és munkatársai, Int.J. Cancer, 19, 546—554 (1977) B = Fáik és munkatársai, Bacteriol. Proc. 38; 191 (1972) C = Kaschka—Dietrich és munkatársai, J. Virol., 44, 295—310 (1982) összefoglaló közlemény Fleckenstein, Biochem. Biophys. Acta 560. 301-342 (1979) Nagyobb mennyiségű sejt előállításához álló tenyészetek helyett rázott tenyészeteket alkalmazunk. Ekkor a sejteket (az 1670 sejtvonalat) például- 10% fetális borjúszérumot tartalmazó RPM11640 tápoldatban 1 vagy 2 literes Erlenmeyer lombikokban rotációs rázógépen tenyésztjük (az 1 literes kiindulási anyagot kaphatunk a további proteinkémiai tisztítási eljáráshoz; 5. A sejtekből izolált RNS-nek közvetlenül kimutatható limfotoxin-mRNS aktivitása van, így kiváló kiindulási anyagot képez a mRNS dúsításához, amely megint lényeges feltétele a mRNS molekuláris klónozásának. A klónozott majom-limíotoxin-mRNS-t ezután, ismert eljárás szerint, próba-anyagként lehet alkalmazni homológ humán limfotoxin-mRNS, illetve a megfelelő gén izolálásánál. A találmány szerinti eljárás módozatait a következő példákkal világítjük meg anélkül, hogy a találmány oltalmi körét a példákra korlátoznánk. 1. példa Limfotoxin termelés herpes vírussal transzformált majom T-limíocita sejtvonalakkal Az alkalmazott 1670 sejtvonalat 10% fetális borjúszérumot, penicillint és streptomicint tartalmazó RPMI1640 tápoldatban tartjuk fenn, álló tenyészetben, 37°C-on, 95% levegőből és 5% széndioxidból álló atmoszférában. A tenyészeteket hetenként háromszor friss tápoldattal hígítjuk. A sűrű tenyészeteket minden kísérletben friss tápoldattal hígítjuk 1:2—1:3 arányban és mindig 5 ml-t teszünk a tenyésztő edényekbe. Három nap múlva centrifugálunk, majd a tenyészet felülúszóját lefagyasztjuk és a vizsgálatig -20°C-on tároljuk. Az alábbi táblázatban a sejtvonalból három különböző tenyészet íelülúszójábol meghatározott limfotoxin aktivitásokat tüntetjük fel. Irodalom Limfotoxin aktivitás RE/ml 1. 2. 3. kísérlet , B, C 88 83 77 lombik 0,5 liter tenyészetet, a 2 literes lombik 1 liter tenyészetet tartalmaz; a fordulatszám percenként 40; hőmérséklet 37°C; normál atmoszféra) és hetenként háromszor friss tápoldattal hígítjuk fel 1:2—1:3 arányban. Ilyen módon minden további nélkül heti 10—100 liter nagyságrendű tenyészetfelülúszó termelése válik lehetővé. Az 1670 sejtek hosszú időn át termelnek limfotoxint: folyamatos tenyésztés mellett a tenyészetek felülúszóiban 9 hónap múlva sem észlelhető a limfotoxin aktivitás szignifikáns csökkenése. \ limfotoxin jellemzése TT) Ä limfotoxin aktivitás biológiai kimutatására a következő vizsgálati módszert 3 5 10 15 20 25 30 35 40 A 55 60 65
