192993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás albicidin antibiotikum előállítására
11 192993 12 bocsátjuk át az antibiotikus aktivitás adszorbeálása céljából. Az antibiotikumot a gyantáról metanollal eluáljuk, és az eluátumot vákuumban bepárolva vizes koncentrátumot kapunk. Az utóbbit acetonnal 95 tréfX aceton-koncentrációig hígítjuk és 12 óráig 5 °C-on tartjuk az inaktiv, nagy mólsúlyú szenynyezések kicsapása céljából. A szűrletet bepároljuk és a maradékot metanolban oldjuk. Az oldatot Sephadex LH-20 géllel (Pharmacia Fine Chemicals) megtöltött 120x2,5 cm-es oszlopon bocsátjuk át 1 ml/min átfolyási sebességgel. A baktériumellenes aktivitást egyetlen csúcsban kapjuk meg Ve=l liter elúciós térfogatnál [Ve/Vo=5,0]. Az egyetlen aktív csúcs anyagát fordított fázisú HPLC-vel kromatografáljuk Hamilton PRP-1 oszlopon (30,5x0,7 cm), majd Beckman ODS oszlopon (25x1 cm), mindkét esetben izokralikus elúciól alkalmazva 1 térfX ecetsavat tartalmazó 44 térf% tetrahidrofurán/víz rendszerrel. A HPLC-t 24 °C-on hajtjuk végre 2 ml/min átfolyási sebességgel. A detektálás az UV tartományban 255 nm-nél történik (2AUFS). A PRP-1 oszlopra az LH-20 oszlopról kapott aktív csúcs 100 pl térfogatát viszszük fel, míg az ODS oszlopra felvitt minta a PRP-1 albicidin-csúcs 500 pl térfogatra. Az albicidin főkomponenst, mely az Ö8szaktivitás 80%-át tartalmazza, az ODS oszlopról utolsóként eluáljuk Ve=78-80 ml elúciós térfogatnál. A rajzok közül a 2. ábra a PRP-1 oszlopról, míg a 3. ábra az ODS oszlopról történő elúció képét mutatja. A nagyobb aktív csúcsok vonalkázva vannak és a ,,/j "-val jelzett csúcs az albicidin-caúcs. Az ODS oszlopról lejött, albicidint tartalmazó egyesített frakciókat lassan elpárologtatjuk a fehér kristályos albicidin kicsapása céljából. A kapott termék UV-spektrumát az 1. ábra szemlélteti. 4. példa Cukornád és kukorica beoltása az X. albilineans izolátumokkal és mutánsokkal Az X. albilineana klorózist okozó törzseinek azonosítása a levélfoltosaág-megbetegedésre érzékeny fiatal fajták beoltása útján történhet, az alábbiak szerint: Levélfoltosság-megbetegedésre érzékeny fiatal H54-2508 cukornádfajta és „Hawaiian Supersweet #9' csemegekukoricafajta fiatal növényeit az új hajtás csúcsa felelt lemetszszük és a friss vágási felületre 3 napos X. albilíneans ferde táptalaj-tenyészetből sűrű szuszpenziót viszünk fel. A beoltott növényeket a szisztémás tünetek megjelenéséig melegházban tartjuk. Csak élesen körülhatárolt fehér ceruzavonalak alakulnak ki a „Hawaiian Supersweet #9” kifejlődő levelein, általában a beoltást követő 2-4 hét múlva. Szisztémás ceruzavonalak, és később a kifejlődő levelek általános klorózisa válik láthatóvá a H54-2508 fajtán, a beoltás után 3 hét és 6 hónap között változó időszakokban. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás albicidin antibiotikum előállítására, amely vízben és acelonilrilben kevéssé oldódó, poláris szerves oldószerekben oldódó, és apoláris szerves oldószerekben lényegében oldhatatlan, fehér kristályos vegyület; molekulasúlya körülbelül 842; és protonmágneses rezonancia spektruma: »H-NMR (DMSO-De, 300 MHz): S 11,567 (1H, széles e), 11,178 <1H, s), 10,597 <1H, s), 10,131 (1H, s), 9,802 (1H, széles s), 9,719 (1H, s), 9,042 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,039 (1H, d, J=8,8 Hz), 8,009 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,939 (1H, d, J=S,9 Hz), 7,870 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,828 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,811 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,600 (1H, széles d, J=8,8 Hz), 7,372 (2H, d, J=8,8 Hz), 7,287 (1H, széles q, J=l,2 Hz), 6,858 (2H, d, J=8,8 Hz), 5,003 (1H, széles td, Jz8,5; 7,8 és 5,6 Hz), 3,931 (3H, s) 3,795 <3H, s), 3,165 (1H, dd, J=-16,9 és 5,6 Hz), 3,097 (1H, dd, J=-16,9 8,5 Hz) 2,136 (3H, d, J=l,2 Hz); szénmágneses rezonancia spektruma: UC-NMR (DMSO-d«, 75 MHz): é 168,89 (s), 168,19 (s), 166,17 (s), 164,86 (s), 163,30 (s), 157,52 (s), 154,49 (s), 149,72 (s), 142,70 (s), 141,86 (s), 140,26 (s), 137,76 (s), 136,15 (s), 135,90, (s), 133,92 (d), 131,31 (d, 2C), 129,51 (s), 128,99 (s), 128,80 (d), 128,36 (d), 127,65 (s), 126,55 (s), 125,70 (d), 125,48 (d), 119,14 (d), 118,95 (d), 118,22 (s), 116,25 (s), 115,39 (d, 2C), 114,94 (d), 110,20 (d), 60,56 (q), 60,22 (q), 50,62 (d), 20,03 (t), 14,57 (q); ultraibolya abszorpciós spektruma: Xraax=308 nm és „váll" 275 nm-nél vizes oldatban, pH 7, 0,01M trisz-HCl puffer, Xmax=213 nm és 308 nm metanolban (10 meg/ml), Bl*ic»=8.10a, Xmax=320 nm és „váll" 350 nm-nél metanolos 0,06 kélium-hidroxid-oldatban; és 37 ®C-on 3 óráig ellenáll a mintegy 50 pg/ml koncentrációjú fehérjebontó pronáz enzim hatásának, azzal jellemezve, hogy a Xanthomonas albilineans LS20 NRRL B-15550 törzset, annak mutánsát vagy variánsát vizes lápközegben, aerob körülmények között tenyésztjük, és kívánt esetben a kapott anlibiolikumol kinyerjük a tápközegből. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kultúrát a stacioner fázis eléréséig tenyésztjük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kultúrát 15“-37 »C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kultúrát 28°-30 «C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
