192962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy gonadotróp aktivítású leteinizáló és ösztron-stimulálo hormonokat felszabaditó faktor analógok előállítására
8 192962 9 génkarbonát oldattal és vízzel való mosás után semleges formában nyerjük. A 3,9 g (93%) peptidet hab formájában kapjuk. A terméket vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat alapján homogénnek találtuk. A vékonyrétegkromatográfiás analízishez szilikagélt és futtatószerként kloroform-metanol 9:1 arányú elegyét használtuk. Aminosav összetétel analízis: D-Tle = 0,92; Leu = 0,98; Arg = 1,01; Pro = 0,93. 5. példa Z-Ser-Tyr-D-Tle~Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (V) előállítása A (IV) képletű vegyiilet 3,6 g-járól platina katalizátoron való hidrogénezéssel eltávolítjuk a védőcsoportot. 3,0 g (4,4 millimól) szabad tetrapeptidet kapunk. A Z-Ser-Tyr Na-mal való kondenzációját vízmentes dimetil-formamid-metilén-klorid elegy ben-30 °C-on hajtjuk végre 1,9 g Z-Ser-Tyr-NíHb-at, 1,5 ml 8 n dioxános sósav-oldatot és 0,9 ml n-butil-nitritet használva. A semlegesítést pH = 8-ig N-etil-piridinnel hajtjuk végre. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-on 3 napon keresztül hűtőszekrényben állni hagyjuk. Az illékony komponenseket ledesztilláljuk és a maradékot etil-acetátban oldjuk. Az oldatot ismételten mossuk egymás után 1 n sósavval, 5% nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal és vízzel, majd szárítjuk és desztilláljuk. így 4,14 g (76%) nem kristályos formájú hexapeptidet kapunk. A termék homogenitását folyadékkromatográfiásán vizsgáltuk meg. (Oszlop méret: 0,4x25 cm; stacionárius fázis: módosított szilikagél, mozgó fázis: 70 tf% metanol és 30 tf% pH = 4,4-es foszfát-puffer elegye). A termék 82% címben jelzett hexapeptidet tartalmaz. Aminosav összetétel analízis: Ser = 1,14; Tyr = 1,05; D-Tle = 0,98; Leu = 1,03; Arg = 1,04; Pro = 1,00. 6. példa pFlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (VI) előállítása Az 5. példában kapott (V) képletű vegyületről (3,8 g) palládium katalizátoron való hidrogénezéssel metanolos oldatban lehasítjuk a védőcsoportot. 3,2 g 88% hexapeptidet tartalmazó terméket kapunk. Az összetételét folyadékkromatográfiásán határoztuk meg, az oszlop mérete és a stacionárius fázis az 5. példában megadottal megegyezik, a mozgó fázis összetétele: 50 tf% metanol és 50 tf% trifluor-ecetsav - trietil-amin pH = 3,9-es puffer, a meghatározást ultraibolya fényben 220 mm-es hullámhossznál végeztük. Az azid-kondenzációt vízmentes dime-6 til-formamid és dimetil-szulfoxid 1:1 arányú keverékében végeztük 1,6 g pGlu-His-Trp-N2H3-t, 3,2 g (V) képletű vegyületet és 0,5 ml n-butil-nitritet használva. A reakciót -fiO °C-on hajtottuk végre, az azidképződés ideje ezen a hőmérsékleten 30 perc. Ezután a reakciókeverék pH-ját 8-9-re állítottuk be és 4 napon keresztül állni hagytuk a hűtőszekrényben -5 °C-on, miközben a pH-ját időnként ellenőriztük. Az oldószerek lehajtása utón a maradékot kismennyiségű éterben oldottuk és a kapott olajos oldatot 30 ml metanollal hígítottuk. A termék etil-acetót - éter keverék hozzáadására kicsapódik. 3,65 g (87%) nyers nonapeptidet kapunk. Folyadékkromatográfiás vizsgálata azt mutatja, hogy a kapott termék 70%-ban tartalmaz nonapeptidet és ezen kívül bizonyos mennyiségű kiindulási anyagot, mint azt a megfelelő kromatográfiás csúcsok mutatták. (Az azonosítás standard mintákkal való keverés révén történt.) A folyadékkromatográfiás meghatározásához a 4. példában említett oszlopot, stacionárius fázist, mozgó fázisként 60 tf% és 7,0-es pH-jú foszfát fuffer elegyét használtuk, a kimutatás 210 nm hullámhosszú ultraibolya fényben történt. A nyers nonapeptid aminosav összetétel analízise: Glu = 1,43; His = 1,41; Trp = 1,10; Ser = 1,09; Tyr = 1,20; D-Tle = 0,89; Leu = 1,00; Arg = 0,88; Pro = 0,90. A biológiai aktivitás értékelése céljából a terméket preparatív kromatográfiásan tisztítottuk a következő körülmények között: oszlopméret: 2,5x30 cm; stacionárius fázis; módosított szilikagél (szemcsemérete: 10 pm), mozgó fázis: 60 tf% metanol és 40 tf% 0,2%-os vizes trifluor-ecetsav, detektálás: 210 nm-en. A nyers nonapeptid mintából 300 ml-t a mozgó fázis 3 ml-ébe befecskendezve 148 mg terméket kapunk 96%-os tisztaságban. Op.: 205-208 °C. (°c)ï)0= -28,5 0 (C = 0,2, dimetil-formamidban) Aminosav összetétel analízise a következő: Glu = 1,01; His = 1,01; Trp = 0,90; Ser = 0,95; Tyr = 1,01; D-Tle = 0,95; Leu = 1,00; Arg = 0,99; Pro = 1,01. 7, példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyi—D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (VII) előállítása A (VI) képletű vegyület 30 mg-os mintáját a fenti módon tisztítjuk és 0,6 ml trifluor-ecetsavban oldjuk. Tioglikolsavat adunk hozzá, és az elegyet 0 °C-ra hűtjük, 0,4 ml trifluor-metón-szulfonsavval kezeljük, és 30 percen keresztül hűtőszekrényben (-5 °C) állni hagyjuk. A terméket ezután éterrel kicsapjuk és szűrőn összegyűjtjük. A kapott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
