192955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkoxi-benzoil-csoporttal acilezett A- 21978C ciklusos peptid-származékok előállítására
15 192955 16 Az A-21 978C Nom-t-BOC komplexei (1185 g nyers szubsztrát, mely körülbelül 176 g A-21 978C komplexet tartalmaz) hozzáadjuk a fermentációs közeghez. A dezacilezést az 1. preparálás B. fejezetében leírtak szerint hajtjuk végre. ITPLC elemzéssel kimutatva a dezacilezés körülbelül 24 óra alatt teljes. C. A-21 978C Nora-t-BOC mag izolálása A B. fejezetben leírtak szerint kapott fermentlevet (100 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel) átszűrjük. A szűrletet 7,5 liter gyantát (DIAION) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át; az oszlopot vízzel (38 liter) mossuk. Az elúciót szilikagél/Cja HPLC-vel ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon UV detektálással. Kevés mag a mosófolyadékkal eluálódik. A magot ezután a következő víz/acet,onitril elegyekkel eluáljuk: (95:5) - 40 liter; (9:1) - 40 liter és (85:15) - 100 liter. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 298,5 g félig tisztított A-21 978C Norn-t-BOC-magot kapunk. D. .4z A-21 9780 Norn-t-BOC mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott, félig tisztított A-21 978C Norn-t-BOC magot (30 g) 0,2% ecelsavat és 0,8% piridint tartalmazó víz/acetonitril (9:1) elegyben (75 ml) oldjuk. Az oldatot 3,33 liter szilikagél (Quantum LP-1] (Ci8 töltetet tartalmazó, a fenti oldószerrendszerrel kiegyensúlyozott 4,7x xl92 cm-es acéloszlopra visszük fel. Az oszlopot nyomás alatt 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó víz/acetonitril/metanol (80:15:5) eleggyel eluáljuk. 350 ml-es frakciókat gyűjtünk és a terméket 280 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószer eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 18,4 g tisztított A-21 978C Nom-t-BOC magot kapunk. Az A-21 978C Nom-t-BOC mag jellemzői a következők: (a) Alak: fehér amorf szilárd anyag, amely rövidhullámú UV fényben fluoreszkál (b) Tapasztalati képlet: C67H91N17O27 (c) Molekulasúly: 1565 (d) Oldhatóság: vízben oldódik (e) IR abszorpciós spektrum (KBr) maximumai: 3345 (széles), 3065 (gyenge), 2975 (gyenge), 2936 (gyenge), ~1710 (váll), 1660 (erős), 1530 (erős), 1452 (gyenge), 1395 (közepes), 1368 (gyenge), 1341 (gyenge), 1250 (közepes), 1228 (közepes), 1166 (közepes-gyenge) éB 1063 (gyenge) cm-1. (f) UV abszorpciós spektrum maximumai (90% et mólban): 220 nm (e 42,000) és 260 nm (c 10,600) (gl HPLC retenciós idő=6 min, 4,6x x300 mm-es szilikagál/Cis oszlopon, víz/acetonitril/metanol (80:15:5) oldószert (0,2% ammonium-acélát tartalommal) használva 2 ml/ /min áramlási sebességgel, UV detektálással. 5. preparálás Az A-21 978C Norn-t-BOC mag alternatív tisztítása A 4. preparálás C. fejezetében leírtak szerint kapott, félig tisztított A-21 978C Norn-t-BOC magot (10,8 g) vízben oldjuk és 80 ml Amberlite IRA-68 gyantát (acelátciklus, Rohm End Hass, Philadelphia, PA) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk és 5 ml/min áramlási sebességgel, egymás útin 0,05n ecetsavoldattal (1080 ml), 0,ln ecetsax oldattal (840 ml) és 0,2n ecetsavoldattal (3120 ml) eluáljuk, 120 ml-es frakciókat gyűjtve. Az oszlop elúcióját analitikai HPLC-vel s:.ilikagél/Ci8 tölteten, 0,2% ammónium-acetátot tartalmazó víz/acetonit.ril/metanol (80:15:6) oldószerrendszert használva ellenőrizzül és a terméket 254 nm-nél UV-monitorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük; az oldat pH-ját piridinnel 5,8-ra állítjuk be; a kapott oldatot vákuumban mintegy 200 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátumhoz vizet adunk és a képződött oldatot a piridin eltávolítása céljából ismét bepároljuk. A maradékból gyorshütéses t zárítás utn 3,46 g tisztított A-21 978C Norn—t—30C magot kapunk. 1. példa N- rp-p-(n-Dodecil-oxi)-benzoil-Norn-t-BOC-A-21978C mag előállítása 2, l,5-Triklór-fenil-p-(n-dodecil-oxi)-benzoátot (0,9 g) és A-21 978C t-BOC magot (0,9 g) 400 ml vízmentes DMF-ban oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten, nitrogénatmoszféra alatt 120 óráig keverjük. Az oldószert csökkentett nyomóson lepároljuk. A maradékot dietil-éter (400 ml) és kloroform (400 ml) elegyével 2 órán át keverjük. A terméket szűréssel elválasztva és szárítva világosbarna port (0,962 g) kapunk. Az anyag egy részét (0,78 g) metanolban (200 ml) oldjuk és preparatív HPLC-bel tisztítjuk, „Prep LC/System 500" egységet (Waters Associates, Inc., Milford, MA) és stacioner íázisként Prep Pak-500/Cis oszlopot (Waters Associates) használva. Az oszlopot izokravikusan eluáljuk víz/metanol/acetonitril (2:1:2) oldószerrendszerrel és 250 ml-es 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
