192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
4 192B92 5 Az alábbiakban ismertetünk egy lehetséges eljárást a sejten belüli enzim kivonására a mikroorganizmusból a tenyésztés után. Először a sejteket kicentrifugáljuk a tápközegból, majd a sejteket vízzel, fiziológiás sóoldattal vagy egy megfelelő pH-értékű pufferoldattal mossuk. A mosott sejteket egy megfelelő pH-értékü pufferoldatban szuszpendáljuk és ultrahanggal, nyomással (french-press) vagy egy enzimmel (lizozimmal) végzett kezeléssel feltárjuk. Ezt követően az elegyet centrifugáljuk, így az oldatból eltávolítjuk az ép Bejteket és a sejttörmeléket, és kapunk egy felülúszó részt, ez a nyers enzimoldat. A nyers enzimoldathoz ammónium-szulfátot adva az enzimet kisózzuk (30-70% telítettségű frakció). A kisózott terméket feloldjuk egy pufferban, amit célszerűen úgy készítünk el, hogy az enzimet ne inaktiválja, és az oldatot a visszamaradt ammónium-szulfát eltávolítása céljából dialízisnek alávetjük. Ezután az enzimoldatot tisztítási eljárásnak (vagy eljárásoknak), így ioncserélő kromatográfiának és affinitás-kromatográfiának alávetjük, így egyetlen komponensként kapjuk a tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktázt. A tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz alábbi fizikai-kémiai tulajdonságait állapítottuk meg: 1) Aktivitás 2, 5-diketo-D-glükon8av + redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát + H* 2-keto-L-gulonsav + nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP*) 5-keto-D-fruktóz + redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát + H+ L-szorbóz + nikotinamid-adenin-dinukleotid-fo8zfát (NADP*) Amint az látható a fenti reakcióban donorként a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot használjuk. Redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid ugyancsak használható donorként a fenti reakcióban, de ebben az esetben a reakciósebesség 1/250 arányban vagy ennél kisebbre csökken, a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot alkalmazó reakcióval összehasonlítva. 2) Fajlagosság a szubsztrátumokra Az enzim fajlagosságot mutat 2, 5-diketo-D-glükonBavra és 5-keto-D-fruktózra. Az enzim azonban nem redukálja az 5- -kelo-D-glükonsavat, ami a fenti két Bzubsztrátummal hasonlóságot mutat és nem mutat redukáló hatást olyan ketózokra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportot tartalmaznak, mint például a D -fruktóz és L-szorbóz, valamint olyan vegyülelekre, amelyek egy ketocsoportot tartalmaznak a 2-helyzetben, mint például a 2-keto-L-gulonsav és a 2-keto- D-glükonsav. 4 2, 5-diketo-D-glükonsav vagy 5-ke~ to-D-fruktóz lényeges termelését 2- -keto-L-gulonsavból, illetve L-szorbózból nikotinamid-adenin-dinukleotid-fo8zfát vagy nikolinainid-adenin-dinukleotid jelenlétében nem tapasztaltuk. 3) Optimális pH pH = 6-7 4) pH-Stabilitás pH = 5-7 (meghatározva a maradék-aktivitások alapján, a kővetkező kezelések után: 0,1 mólos dimetil-glutársav pufferral 4- -5 pH-értéken, 0,1 mólos Good pufferral (PIPES) 6-7 pH-értéken és 0,1 mólos trisz-HCl pufferral 8-9 pH-értéken, 28 °C-on 30 percig kezelve. 70% vagy ennél több maradék-aktivitást tapasztaltunk 5-7 pH-értéken, míg csak 30%-ot vagy ennél kevesebbet 4 pH-értéken vagy ez alatt és 8 pH-értéken vagy e felett. 5) Az enzimaktivitás mérése Az enzimaktivitást spektrofotometriálisan mérjük az abszorpció csökkenése - alapján 340 nm-en, ami összhangban van a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfót oxidációjával, mint az enzimreakció mértékével, 30 °C-on, 0,1 mólos triBZ-pufferban (pH = 7), amely 0,1 mmól redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot és 3,3 mmól 2, 5-dikelo-D-glükonsav-kalcium8Ót tartalmaz. Az enzimaktivitás egysége az a mennyiség, ami 1 perc alatt 1 /umól redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfétot oxidál. 6) A reakció hőmérséklettartománya 25- -45 "C 7) A pH-érték és a hőmérséklet inaktiválási körülményei Az aktivitásnak 96%-a vagy még nagyobb része elvész, ha az enzimet 28 üC-on 2 órán át 4 pH-értéken vagy ez alatt vagy 8 pH-értéken vagy efelett tartjuk. 8) Inhibitorhatás, aktiválás és stabilizálás Az enzimre inhibitorhatással van az oxalát és kis mértékben a glicerinaldehid. Az enzim aktivitása Mg'* vagy Mn** hozzáadására észrevehetően nem nő. Az enzimet glicerinnel nagy koncentrációban (30-50%) vagy szacharózzal (1 mólos) stabilizáljuk. 9) Molekulasúly 29.000±2.000 (SDS-poliakrilamid elektroforézissel és gélszűréssel mérve). 10) Izoelektromos pont 4,4±0,3 pH-értéken (izoelektromos pont-elektroforézisBel mérve). 11) Km-érték (Michaelis konstans) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
