192752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sziszomicin előállítására mikrobiolóiai úton
9 192752 10 A találmány szerinti eljárás foganatosítására a következő kiviteli példákat ismertetjük: 1. példa Micromonospora purpureonigra IM-9 (MNG 00225) törzs mélyhűtve (-20 °C-on) tárolt vegetativ micéliumának 1 ml-ével (élőcsíraszám 106-107/ml), steril körülmények között 3000 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 800 ml steril táptalajt összetétele a következő: tryptone (Oxoid) szójaliszt oldható keményítő oltunk be, melynek 5 g 10 g 20 g glükóz kalcium-karbonát. csapvíz 1 g 2 g 1000 mi-re Megjegyzés: a .tryptone" kereskedelmi név. Speciálisan mikrobiológiai célokra készített pankreászos kazein-hidrolizátum. Az elegy pH-ját sterilezés előtt 7,0-re állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260 fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32 °C-on 3 napig' inkubáljuk. Az így kapott tenyészettel steril körülmények között 5 liter termelő táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: szójaliszt 40 g kukorica-keményítő 10 g dextrin 25 g kazein-hidrolizátum (száraz súly) 10 g kalcium-karbonát 4 g magnézium-szulfát-víz (1/7) 2 g glükóz 5 g vas(II)-szulfát-viz(l/7) 0,2 g kobalt-nitrát 0,8 g pálmaolaj 2 g csapvíz 1000 ml-re A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 8,0-ra állítjuk be. A sterilezést. autoklávban végezzük 121 °C-on, 90 percig. A tenyésztést 10 literes üvegfermentorban végezzük 32 °C-on, a keverő és a mintavevő saválló acél. A keverés fordulatszáma 750/perc, a levegőztetés: a fermentorban lévő folyadék térfogatával azonos térfogatú levegővel történik percenként. Habzásgátlóként pálmaolajat használunk. Az antibiotikum-termelés a fermentáció 24-30. órájában indul meg, s a maximális értéket a 90-100. órában éri el. A fermentáció befejezésekor a ferment.lé összes biológiai aktivitása sziszomicin standardra vonatkoztatva 600 pg/ml. 2. példa Az 1. példa szerint előállított 10 liter, 600 jug/tnl biológiai aktivitású ferment .léhez 5 keverés közben 500 g ammónium-szulfátot adagolunk, majd a ferment.lé pll-ját 10 n kénsav-oldal.tal 2-re állítjuk be. A savas fermentlél. 30 percig keverjük, majd leszűrjük. A micéliumot 3,5 liter vízzel átmossuk, 10 majd a mosófolyadékot a szűrlettel egyesítjük. A kapott. 11,4 liter szűrlet pll-ját. 25%-os ammónium-hidroxid oldattal 7-re állítjuk be. Ezután a szűrlethez addig adagolunk telített, vizes oxálsav-oldatot, amíg a kalcium-ionok 15 teljes leválasztását el nem érjük. A savas oldatok 15 percig keverjük, majd a pH-ját 25%-os ammónium-hidroxid oldattal 7-re állítjuk be. Ezután a csapadékot kiszűrjük, és így 11)0 liter, 433 pg/ml biológiai aktivitású 20 szürletet kapunk. A nyert szűrletet 250 ml, ammónium-formájú Wofat.it 00-300 gyantát tartalmazó oszlopon (oszlopátmérő 3,2 cm, gyantai'étegmagasság 35 cm) folyatjuk át 1000 ml/óra sebességgel. A megkötés befejez- 25 tével a gyantaágyat 1000 in 1 ionmentes vízzel mossuk, majd 600 ml 2 n ammónium-hidroxid oldattal elítéljük 200 ml/óra sebességgel. Az eluálás során 20 ml-es frakciókat szedünk, amelyekben a sziszomicirit. vékonyrétegkroma- 3C tográfiás vizsgálattal mutatjuk ki, adszorbensként szilikagélt., kifejlesztő elegyként kloroform : metanol : 25%-os ammónium-hidroxid (1 : 1 : 0,4) elegyet, előhívó reagensként 0,5%-os acetonos ninhidrin-oldatot. al- 35 kalmazva. A sziszomicint tartalmazó frakciókat egyesítjük, majtl vákuumban 20 ml térfogatra bepároljuk. Ezután az oldat pH-ját 5 n kénsavoldattal 7,5-re állítjuk be, majd az oldatot 250 mg aktív szén jelenlétében 15 percen át keverjük és leszűrjük. A szürletet 130 ml, ammónium-formájú Amberlite CG-50-1 gyantát tartalmazó oszlopra (oszlopát mérő 2,5 cm, gyantarétegmagasság 29,5 cm) visszük fel. A gyantaoszlopot 500 ml ionment.es vízzel mossuk, majd a kísérő szennyezéseket. 2000 ml 0,1 n ammonium-hidroxid oldattal, a sziszomicint pedig 1000 ml 0,2 n ammónium-hidroxid oldattal leoldjuk. A leoldás sebessége 200 ml/óra. Az eluálás során 20 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket vékonyrétegkromatográfíás módszerrel' analizálunk a fent leirt módon. A csak sziszomicint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A bepárlási maradékot ^ benzol-etanol eleggyel vízmentesítjük, majd vákuumban foszforpentoxid felett súlyállandóságig szárítjuk. így 3,3 g tiszta sziszomicin-bázist kapunk. Átkrist.ályosít.ás után: o.p.: 198-201 °C; [ocId = +188° (c = 0,3, viz). A kapott, sziszomicin-bázist 15 ml ion6
