192646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új N-alkil-peptid-aldehidek előállítására
1 2 192 646 A találmány tárgya eljárás I általános képletű új N-alkil-peptid-aldehid-sók ahol Rj jelentése hidrogénatom vagy 1 —6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, R2 jelentése 1—6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, továbbá R! és R2 az Xxx alfa-aminosav aminocsoportjához kapcsolódik, Xxx jelentése D-fenilalanin-csoport vagy D-alloizoleucin-csoport, Pro jelentése L-prolin-csoport, Yyy jelentése L-, D- illetve DL-arginín-csoport és A jelentése savmaradék - előállítására. Rt és R2 jelentése a fentiek értelmében metil-, etil-, propil-, n-butil-, izo-butil- vagy n-hexilcsoport lehet. Yyy jelentése előnyösen L-arginin-csoport. A jelentése egy ásványi savmaradék, így pl. sósav-, kénsav-, foszforsav-maradék, vagy egy szerves savmaradék, így pl. ecetsav-, borkősav-, moleinsav-, furánsav -maradék lehet. Ismeretes, hogy a véralvadék képződése és az alvadék oldása egyaránt proteolitikus reakció eredménye. Az alvadékképződés folyamatában a kulcslépés a trombin-fibrinogén reakció, amelyben a vérplazmában oldott fibrinogén átalakul a már nem oldódó fibrin polimerré. Az oldási folyamatban pedig a plazmin proteolitikus hatása érvényesül, a polimer fibrint lebontja oldható fragmentumokká. A terápiás felhasználásra szánt alvadásgátlóktól elváijuk, hogy az alvadási folyamat gátlása mellett az alvadók oldását (a plazmin-fibrin reakciót) ne akadályozzák. Ilyen tulajdonságú alvadásgátlók a H-D-Phe— Pro—Arg—H szerkezetű szabad tripeptid-aldehid-sók (169 870 lsz. és 184 368 lsz. magyar szabadalmi leírások). Ezek a vegyületek a plazmin-fibrin reakciót nem befolyásolják. Jelenlétükben — koncentrációtól függően — vagy nem keletkezik fibrín-alvadék, vagy laza alvadék keletkezik, amelyet a plazmin könnyen felold. Ismert azonban az is, hogy a szabad aminoterminálisú tripeptid-aldehidek bomlékony vegyületek, kezdeti nagy enzimgátló hatásukat viszonylag gyorsan elvesztik, és csak a 184 368 lsz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett H—D—Phe— Pro— Argil— szulfát rendelkezik jelentős stabilitással, amenyiben hütött (5 °C-os) oldatban hosszabb időn át megőrzi kezdeti nagy aktivitását. A H—D-Phe—Pro—Arg-H-szulfát stabilitását emelt hőmérsékleten vizsgálva megállapítottuk, hogy vizes oldatban 80-100 °C-on már néhány óra alatt, 37-40 °C-on 10-14 nap alatt gyakorlatilag teljesen átalakul egy — enzimgátló hatással már nem rendelkező — stabil triciklusos vegyületté, melynek szerkezetét tömeg- és NMR-spektroszkópiával igazoltuk (l,2,4,5,6,6a-hexahidro-l-benzil-2-oxo-8 [4’-quanidino] butil-pirrolo [1,2-a], imidazolo [2,1 -c], pirazin). Azt is megállapítottuk, hogy a megfelelő acil-tripeptid-aldehidek nem szenvednek ilyen jellegű irreverzibilis átalakulást, de az acil-származékok, pl. a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H-hemiszulfát (Boc jelentése terc-butil-oxi-karbonil-csoport), a trombin-fibrinogén reakció mellett a plazmin-fibrin reakciót is számottevően gátolják [184 368 lsz. magyar szabadalmi leírás, valamint S. Bajusz et al., in: Peptides, Synthesis-Structure-Function (eds.: H.D. Rich and E Gross), Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois, USA, 5 817. oldal], tehát az antikoaguláns terápiában kevésbé alkalmazhatók. A találmány célja olyan új peptid-aldehidek előállítása, amelyek rendelkeznek az ismert H-D-Phe— Pro—Arg-H-szulfát szelektív véralvadásgátló hatásá- 10 v *1, de ennél stabilabbak, irreverzibilis ciklizálásra nem hajlamosak. Azt találtuk, hogy a H-D-Phe-Pro-Arg- 1 .H2S04 esetében fellépő irreverzibilis átalakulás, az e nlített vagy ahhoz hasonló triciklusos vegyület kép- 15 ződése elmarad az I általános képletű, azaz az aminotrrmínálison alkilezett tripeptid-aldehideknél, pl. az N-metil-, N-etil- vagy N-izobutil-D-fenilalanil-L-prolil- E-arginin-aldehid-szulfátnál [I általános képletben R, = H, R2 = CH3, CH2CH3, illetve CH2CH(CH3)2, 20 Xxx = D—Phe és (HAjj = H2 S04 ]. Vizsgálataink során í H—D—Phe-Pro—Arg—H-szulfátot, valamint a megfelelő N-alkil-származékokat 10 mg/ml töménységben oldottuk vízben (pH = 6,0) és 40 °C-on tartottuk 5 napon át. Az anyagok szerkezetének változását kro- 25 matográfiás vizsgálattal és az antitrombin aktivitás meghatározásával követtük nyomon. A szilikagél vékonyrétegben 30:20:6:11 arányú etil-acetát-piridin-ecetsav-víz elegyben végzett kromatográfiás vizsgálat egyértelműen mutatta, hogy a 30 il— D-Phe—Pro-Arg—H.H2S04 fokozatosan átalakul: a tripeptid-aldehidre jellemző folt (Rf = 0,40) nellett — ennek kárára — fokozatosan erősödik a triciklusos vegyület foltja (Rf = 0,60). Ezzel szemben az N-metil-, N-etil- és N-izooutil-, valamint az N,N- 35 dimetil-származék oldatának kromatográfiás vizsgálata nem utalt ilyen átalakulásra, csak a peptidek foltja (Rf = 0,43, 0,50,0,64 illetve 0,37) volt látható. Megjegyezzük, hogy az N-alkil-tripeptid-aldehidek egyéb sói, pl. acetátjuk sem alakul át a fentinek meg- 40 felelő triciklusos vegyületté, míg a H-D-Phe-Pro— Arg-H-acetát különösen hajlamos ilyen átalakulásra. Az antitrombin aktivitási értékeket az alábbi komponensekből álló rendszerben határoztuk meg: 45 0,2 ml 0,5%-os marhafibrinogén 0,9%-os konyhasó oldatban, 0,1 ml trisz(hidroximetil)-amino-metán-klórhidrát-sósav puffer (pH = 7,2), amely a pepti-doldatot tartalmazza, és 50 0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bcthesda, Maryland, USA) 10 egység/ml oldat. A rendszer alvadási ideje a peptid nélkül 15 s ,,Schnither-Gross Coagulometer”-ben meghatároz- 55 va (kontroll). A tripeptid-aldehid-szulfátok kezdeti aktivitásának jellemzésére azt a mólkoncentrációt adjuk meg, amelyben a peptid a rendszer alvadási idejét a kontroll ötszörösére nyújtja (Ig0 érték). Az oldatban lévő peptidek 1., 3. és 5. napon mért aktivitását 50 a kezdeti (0. napon mért) aktivitás %-ában adjuk meg. Az eredményeket az I. táblázatban foglaltuk össze. 2
