192587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptid tipusú anyarozs-alkaloidok dúsítására és tisztítására
1 192 587 2 végzünk. Az így nyert feltárt sejtes fermentlé 50 1-ét egyenként 1,5 kg EX 207-es gyantát tartalmazó mozgóágyas sorbakapcsolt oszloppáron vezetjük keresztül 15 1/óra sebességgel. A gyantát vízzel, NaHC03 3 %-os vizes oldatával, majd ismét vízzel átáramoltatva semlegességig ill. a mosóvíz színtelenedéséig mossuk, s végül 20 1 metanollal eluáljuk. A nyert alkaloidot pl. a metanol lepárlásával szilárd formába hozhatjuk. A termék súlya 77,8 g, összalkaloidtartalma 87 %, ezen belül az ergokrisztin 71,0 %, az ergokrisztinin 6,4 %, az ergotamin 8,5 %, és az ergotaminin 1,0 %. A termék 13 % nem azonosított ballasztanyagot tartalmaz. Az adszorpciós-eluciós folyamat kitermelése összalkaloidra számítva: 74,4 %. A terméket kívánt esetben pl. a következőképpen dolgozzuk fel kiszerelhető hatóanyaggá: 5 %-os foszforsavas vízben feloldjuk, majd pH 3,8-4 értéknél az ergokrisztint benzollal szelektíven extraháljuk, és bepárlás után 64,2 g ergokrisztin benzolkristályt nyerünk. 2. példa MNG 0088 számon deponált Claviceps purpurea variáns törzs H-jelű táptalajon nőtt tenyészetét 750 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 200 ml I-jelű táptalajra oltjuk, majd 24 °C-on 3 napig inkubáljuk. A kapott tenyészetet 10 literes laboratóriumi fermentorban levő 5 liter K-jelű táptalajra oltjuk, majd 3 napon át 24 °C-on keverve és levegőztetve inkubáljuk. Az így nyert inokulumot saválló, keverősfermentorban lévő 1001 St táptalajra oltjuk és a tenyészetet 24 °C-on kevertetve és levegőztetve 6 napig fermentáljuk. A fermentáció leállása után a fermentlé pH értéke 4,5, összalkaloidszintje 1,00 mg/ml. Az alkaloid-komponensek mennyisége folyadékkromatográfiás módszerrel meghatározva: 0,435 mg/ml ergokornin és epimerje 0,262 mg/ml a-ergokriptin és epimerje, 0,123 mg/ml /3-ergokriptin és epimerje, valamint 0. 280 mg/ml ergometrin és epimerje. A fermentlé 50 literéből nagyfordulatszámű keverős homogenizálóban (2000 ford/perc) 10 percig sejtroncsolást végzünk. Az így nyert 50 1 feltárt sejtes fermentlevet 1,0—1,10 kg EX 207-es gyantát tartalmazó mozgóágyas oszloppáron vezetjük keresztül 18 1/óra sebességgel. A gyantát az 1. példában említett módon mossuk, majd a gyantáról az alkaloidokat 20 I izopropanollal eluáljuk. (Ősszalkaloid koncentráció 2,508 mg/ml, ezen belül az alkaloidok aránya a kiindulási fermentléhez viszonyítva változatlan.) A 20 1 izopropanolos oldat ősszalkaloid tartalma így 50,1 g, ami 91,2 %-os kitermelésnek felel meg az adszorpciós-cluciós folyamatban. Az alkaloidokat tartalmazó izopropanolos oldatról az izopropanolt lepároljuk, miközben az alkaloidokat savanyú vízbe átoldjuk. Az így nyert savanyú vizes oldatból az alkaloidok elválasztása ismert módon pl. a következőképpen történik: pH: 5 értéknél etüacetáttal az ergokornint, a- és ß-ergokriptint és epimerjeiket kivonatoljuk, majd ugyanazon oldószerrel pH: 8 értéknél az ergometrint és epimerjét extraháljuk. Az ergokornin-ergokriptint benzolkristály formájában (32,7 g), az ergometrint bimaleát-só formájában (15,1 g) izoláljuk. 3. példa A 2. példa szerint előállított feltárt sejtes fermentlé 50 literét, mely 0,435 mg/ml ergokornint és epimerjét, 0,262 mg/ml a-ergokriptint és epimerjét, 0,123 mg/ml, /3-ergokriptint és epimerjét, valamint 0,280 mg/ml ergometrint és epimerjét tartalmazza, 2,0 kg EX 207-es gyantát tartalmazó mozgóágyas oszlopon vezetjük keresztül 15 1/óra sebességgel. A gyantát az 1. példában leírt módon mossuk. A gyantából első lépésben 10 1 metanollal az ergometrint és epimerjét eluáljuk (Az eluátum 1,090 mg/ml ergometrint és ergometrinint tartalmaz, valamint , ergotoxin-típusú alkaloidokat 0,054 mg/ml mennyiségben), második lépésben pedig az ergotoxin-típusú alkaloidokat 10 1 2 % foszforsavat (85 %-os) tartalmazó metanollal eluáljuk. A második eluátum-frakció össz-ergotoxin tartalma 3,31 mg/ml, és csak nyomokban tartalmaz ergometrint. Az adszorpciós-eluciós lépésben a kitermelés ergometrinre 77,9 %, ergotoxinokra 80,8 %. Az ergometrint bimaleát formájában a következőképpen nyerjük ki: az első metanolos eluátum-frakciót vákuumban 40 °C-on 500 ml-re bepároljuk, majd a sűrítményhez adagoljuk az előzőleg 25 ml metanolban feloldott 6,0 g maleinsavat. Kitermelés: 14,22 g nyers ergometrin meleát (alkaloid tartalma 70,5 %). A foszforsavas-metanolos eluátum-frakció szárazra párlásával 43,8 g ergotoxin-foszfát csapadékot nyerünk (alkaloid-tartalom 75,5 %), melyet ismert módon 28,9 g ergokornin-ergokriptin benzolkristállyá alakíthatunk. (Alkaloid-tartalom 80 %.) 4. példa MNG 00186 számon deponált Claviceps purpurea variáns törzs H-jelű táptalajon nőtt tenyészetét 750 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 200 ml K-jelű táptalajra oltjuk, majd 24 °C-on 3 napig inkubáljuk. Az így nyert tenyészetet 10 1-es üvegtermen torban sterilezett 5 1 K-jelű táptalajra oltjuk. Az oltótenyésztést 24 °C-on levegőztetve, és kevertetve 3 napon keresztül végezzük. Az ígynyert tenyészettel saválló acélfermentorban sterilezett 100 1 St-táptalajt oltunk. A tenyésztést levegő átáramoltatás és keverés közben 24 °C-on 6 napig folytatjuk, A tenyésztés végén a fermentlé pH-ja 5,2, és a következő alkaloidokat tartalmazza: 0,351 mg/ml ergokornin és epirneije, 0,137 mg/ml a-ergokriptin és epimerje, valamint 0,152 mg/ml /3-ergokriptin és epimerje. A fermentlé 50 1-ét a 183.266 sz. magyar szabadalmi leírás szerint 30 1 etilacetáttal kivonatoljuk, az extraktumot vákuumban 10 1-re besűrítjük. A sűrítmény 2,431 mg/ml ergotoxint tartalmaz. Ezután a sűrítményt víz-formamid-foszforsav (85 %) 85 : 10 : 5 arányú elegyével kivonatoljuk, és a kapott 30 1 savanyú vizes extraktumot (alkaloidtartalom 7,7 mg/ml) 3 db egyenként 150 g HP 20-as gyantát tartalmazó, sorbakötött nyugvóágyas oszlopon vezetjük keresztül. A gyantát 1,0 1 0,25 % nátrium-hidroxidot tartalmazó vízzel, majd vízzel mossuk, míg az utolsó részlet semleges lesz. A gyantáról az alkaloidokat 1,2 1 2 % foszforsavat (85 %) tartalmazó etanollal eluáljuk. Az eluátum alkaloidtartalma: 16,95 mg/ml. Az adszorpciós-eluciós lépés hatásfoka 88,2 %. Az ergokornin-ergokriptin kinyerését a továbbiakban ismert módon pl. a 180.056 számú magyar szabadalmi leírás szerint végezzük. 5 ‘0 15 20 25 30 35 40 15 50 55 30 35 4
