192587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptid tipusú anyarozs-alkaloidok dúsítására és tisztítására
1 192 587 2 A találmány tárgya új eljárás peptid-típusű anyarozs-alkaloidok dúsítására és tisztítására. Peptid-típusú anyarozs-alkaloidok az ergotoxin komponensei (ergokornin, ec-, és 0-ergokriptin, továbbá az ergokrisztin, valamint C8-epimerjeik), az ergotamin, ergozin és epimeijeik, továbbá ezek egyszerű származékai, mint pl. a 2-bróm-a-ergokriptin [Stoll: Helv. Cilim. Acta 26, 1570 (1943), és 28, 1283 (1945), Smith: J. Chem. Soc. 1937, 396, DE 1 926 045], A peptid-alkaloidok gyógyászati felhasználása széleskörű, főként érműködési rendellenességek és migrén kezelésére, prolaktin szekréció gátlóként stb. alkalmazhatók. A peptid-alkaloidokat gombatörzzsel fertőzött rozsnövény extrakciójával, vagy gombatörzsek alkalmazásával végzett fermentációval, vagy újabban szintetikus úton állítják elő, majd a kapott extraktumot (fermentlevet, vagy reakcióelegyet) fáziscserés tisztítással (171 659, 180 287 számú magyar, 2 840 670 számú NSZK-beli szabadalmi leírások) és/vagy kromatografálással (164 116 számú magyar szabadalmi leírás) tisztítják, dúsítják. Az 1 158 380 számú brit szabadalmi leírásban a nyerstisztítást fáziscserével, a finomtisztítást kromatográfiával végzik. Minthogy a peptid-alkaloidok vízben gyakorlatilag nem oldódnak, mind a fáziscserés, mind a kromatográfiás módszerek nagy volumenű szerves oldószerfelhasználással járnak. A fáziscseréknél pH állításra többször is sor kerül, s nincs olyan tisztítási mód, mely mind a fermentativ, mind a drogeredetű peptid-alkaloidok tisztítására egyaránt alkalmas volna. A dúsítás—tisztítás egyszerűbb, és hatékonyabb megoldására irányuló kísérleteink során azt találtuk, hogy noha a peptid-alkaloidok praktikusan nem oldódnak vízben - azok vizes közegből jó hatásfokkal adszorbeáltathatók pl. Amberlite típusú makroretikuláris gyantákon, melyeket pl. a 3 531 463 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, illetve Diaion típusú makroretikuláris gyantákon, melyeket a Diaion manual, (Tokyo, 1984, Mitsubishi Chem. Industries Ltd) ismertet. A peptid-alkaloidok ezután a gyantáról - adott esetben szelektíven — dsszorbeálhatóak. Szelektív deszorpcióra eluens-vállássál van lehetőség, amikoris a vízoldható anyarozs-alkaloidokat és a peptid-alkaloidokat más-más eiuenssel oldjuk le a gyantáról. Ezzel a módszerrel igen nagymérvű (20-60-szoros) alkaloidtisztulás, és jelentős térfogatcsökkenés (dúsulás) érhető el, és az eluátumból egyszerű, önmagában ismert módszerekkel jó minőségű termék nyerhető. A megoldást meglepően újnak tartjuk, mert a makroretikuláris gyantákat eddig csak olyan bioaktív anyagok tisztítására használtak és ajánlottak, melyek vízoldhatók, és a vízben oldott állapotban vannak jelen (3 531 468 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A szelektív deszorpció lehetőségének felismerése is a jelen megoldásban realizálódik először. A találmány tárgya eljárás peptid-típusú anyarozs-alkaloidok adszorpciós módszerrel történő tisztítására és dúsítására, oly módon, hogy az adott esetben vízoldható anyarozs-alkaloidokat is tartalmazó peptid-alkaloidokat vizes közegben önmagában ismert módszerekkel valamely makroretikuláris gyantán megkötjük, és a gyantáról először a festék- és zsíranyagokat 9-14 pH-ra lúgosított vízzel leoldjuk, majd a peptid-típusú anyarozs-alkaloidokat valamely vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk, vagy szelektív elució esetén a vízoldható alkaloidokat alkanollal vagy vizes alkanollal, majd a peptidtípusú alkaloidokat szervetlen savat vagy vízzel elegyedő szerves savat tartalmazó vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk. A találmány szerinti eljárás értelmében peptid-típusú anyarozs-alkaloidokat tisztítunk, illetve dúsítunk. Fermentativ úton előállított peptid-alkaloidok lehetnek pl. az ergokrisztin és epimerje, melyek előállítását Amici és munkatársai Írták le [Appl. Microbiol. 18, 464—468 (1969)] (termelő törzs: ATCC 20103, deponálás időpontja: 1968, deponálás helye: Amer. Type Culture Collection, Rockville (Maryland USA), ergokornin, evés (3-ergokriptin, valamint epimerjeik (termelő törzsek pl.: MNG 0088, deponálva 1972. január 25-én, OKI, Budapest, mely törzs alkalmazását pl. a 164 816 számú magyar szabadalmi leírás ismerteti, MNG 00186, deponálva 1979. május 9-én, OKI, Budapest, mely törzs alkalmazását a 178 405 számú magyar szabadalmi leírás ismerteti). Az ergotamint és epimerjét drog-extrakcióval nyerjük (termelő törzs: MNG 00208, deponálva 1981. október 8-án OKI, Budapest), a törzs alkalmazását a T/30266 számon közzétett magyar szabadalmi leírás ismerteti. Fermentációban pl. a következő táptalajokat alkalmazhatjuk: E-jelű táptalaj összetétele: szacharóz 100,0 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 g/1 1-aszparagin 10,0 g/1 magnézium-szulfát 0,25 g/1 kálium-klorid 0,120 g/1 kálcium-nitrát 1,000 g/1 vas(JI)-szulfát 0,02 g/1 cinkszulfát 0,015 :g/i agar-agar (Difco) 18,0 g/i A fenti komponenseket 800 ml vízben oldjuk, a pH értéket 15 %-os vizes ammónium-hidroxid-oldattal 6-ra ál-Htjuk be, majd a térfogat 1000 ml-re való kiegészítése után 110 °C-on 25 percig sterilezzük. F-jelű táptalaj összetétele: szacharóz 100,0 g/1 bortfStyánkősav 10,0 g/1 kálium-klorid 0,30 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0,75 g/1 magnézium-szulfát 0,70 g/1 vas(ll)-szuifát 0,007 g/1 cinkszulfát 0,006 g/1 mangánszulfát 0,005 g/1 G-jelű táptalaj összetétele: szacharóz 200,0 g/1 borostyánkősav 12,5 g/1 kálium-klorid 0,3 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0,75 g/1 magnézium-szulfát 0,70 g/1 . vas(Il)-szulfát 0,020 g/1 cinkszulfát 0,020 g/1 mangánszulfát 0,007 g/1 Az F és G összetételekből az E-táptalajnál leírt módon készítünk táptalajt. H-jelű táptalaj összetétele: mannit 40,0 g/1 citromsav 7,0 g/1 kukoricalekvár 2,0 g/1 káliuin-dihidrogén-foszfát 1,0 g/1 magnézium -szulfát 0,3 g/1 agar-agar (Difco) 25,0 g/1 5 = 0 15 50 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
