192579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orálisan adagolható immunogén kompozíció előállítására
1 192 579 2 ben áztatjuk a kálcium-klorid fölöslegének eltávolítása céljából. A gyöngyöket szívópapíron szobahőmérsékleten megszárítjuk, a végső nedvességtartalom 15—16 tömeg%. 2. Példa Gélképzőanyagként nátrium-alginátot használunk, ezenkívül glicerolt nedvesítőszerként, 50 ml 11 tömeg%-os Manucol LB nátrium-alginát vizes oldatát összekeverjük 5 ml 1. példa szerinti kokcidia oociszta szuszpenzióval és 50 ml glicerollal. Ezt az elegyet az 1. példa szerint ülepítjük, azzal a különbséggel, hogy a fölösleges kálciurn-kloridot a gélgyöngyökből 50-50 %-os víz és giicerol elegyben éjszakán át történő áztatással távolítjuk el. A szárított gyöngyök végső nedvességtartalma ebben az esetben is 15—16 tömeg%. Az előző két példában kapott alginátgyöngyökben levő kokcidia oociszták életképességét a következő kísérlettel vizsgáltuk. Az alginátgyöngyöket néhány napig dehidratált formában tároltuk, majd 500 g szokásos csirketáppal kevertük úgy, hogy kb. 2500 gyöngyöt tartalmazzon a kész tápszer. A mintákkal két napig etettünk két 30 napos csirkét kívánság szerinti alapon. Mindkét csirke a kokcidiózis klinikai tüneteit mutatta, az oociszta-tanalmú táplálék fogyasztása után az 5. és 6. napon vér volt az ürülékükben. Ez a teszt azt mutatja, hogy nagyszámú kokcidia oociszta maradt életképes az eljárás során, és képes maradt arra, hogy kiszabaduljon a cisztából a bélben, annak ellenére, hogy szilárd alginátgélbe volt ágyazva. 3. Példa Ezt a kísérletet annak igazolására végeztük, hogy nagyon kisszámú életképes betokozódott oociszta a találmány szerinti kompozícióban csirketáphoz keverve ellenőrzött klinikai tüneteket nem okozó fertőzést tud okozni, ha érzékeny állatoknak adjuk. A 27 napig tartó kezelés után keletkezett immunitást 50 000 oocisztával történő próbafertőzéssel teszteltük. Két 12—12 egyedből álló csoportot használtunk. Az egyik csoport oocisztát tartalmazó diétát kapott egynapos korától, míg a másik csoport oocisztamentes diétát kapott. Az állatokat dróthálón tartottuk, így az oociszta diétából származó oociszta ürítés könnyen ellenőrizhető volt. A helyiséget, ahol az állatokat tartottuk a maradék oocisztától gondosan mentesítettük. Az oocisztákat úgy nyertük, hogy négyhetes Cobb broiler csirkét egyszeri 50 000 oocisztát tartalmazó orális dózissal fertőztünk. A fertőzés után 6,7 és 8 nappal öszszegyűjtöttük az ürüléküket, összekevertük kb. kétszeres térfogatú 2,5 %-os vizes kálium-dikromát-oldattal, és egyenletes péppé homogenizáltuk. A pépet nylongézen átszűrtük, és a szűrlctből a következőképpen végzett sóflotációval nyertük ki az oocisztákat. Először az oocisztákat 1000 g-vel 15 percig végzett centrifugálással kiülepítettük, majd az üledéket újra szuszpendáltuk telített vizes nátrium-klorid-oldatban. Ezt újra centrifugáltuk 500 g-vel 10 percig, és a maradék oociszta szuszpenziót 10-szeres térfogatú desztillált vízzel hígítottuk. 1000 grvel 15 percig végzett centrifugálással az oocisztákat pelyhek formájában kaptuk. Az egész sóflotációs eljárási megismételtük és végül a kapott oociszta pehyheket 2,5 %-os vizes kálium-dikromát-oldattal tettük fel. A kivont oociszták a szuszpenzió 4 napig 28 DC-on végzett levegőztetése után betokozódtak. Ezt a szuszpenziót 4 °C-on foszfát-pufferben tartottuk. A z 1. példa szerint gyöngyöket készítettünk azzal a különbséggel, hogy összesen 30 000 betokozódott kokcidia oocisztát használtunk. 240 gyöngyöt adtunk 3 kg csirketáphoz, és ezt újonnan kikelt csirkéknek adtuk 3 hétig. A kiválasztott oociszta szintet ellenőriztük minden csoportnál, és az eredményeket az 1. ábrán ábrázoltuk. viz oociszták életben maradtak a tápban a kísérlet ideje a'att, oociszták ürültek a 8. naptól az immunizálási perióduson keresztül, ahogyan az az 1. ábrán látható. Nyüvánvaló az oociszta ürítés diagramjából (1. ábra A voml), hogy valóságos immunitás kezdődött kialakulni nem sokkal a kéthetes kor elérése után, mivel hirtelen oociszta ürítés növekedés jelentkezett, és a 21. naptól ez lecsökkent. Az immunizáló oociszták nem okoztak észlelhető patogén hatást. Nem volt megfigyelhető véres ürülék az imirunizáló periódus ideje alatt, és ami lényeges, az átlagos súlygyarapodás, a kontroll és az immunizált csoportnál látszólag azonos volt a próbafertőzés napjáig. Az 50 000 oocisztával végzett próbafertőzés (C) a 27. napon súlyos betegséget okozott a kontroll csoportban, ami az ürülékben megjelenő vérből és bőséges oociszta ürítésből volt megítélhető (1. ábra, B vonal). Ez az immur izált csoportot láthatóan nem súlytotta, de elhullás egyik csoportban sem volt megfigyelhető. 4-7. Példák í zekkel a példákkal a töltőanyagok alkalmazását szemléltetjük az alginátgyöngyök képzésénél. Gyöngyöket készítünk az 1. példa szerint az alábbi oldatokat használva. Példa Alginát Töltőanyag 4 1 % Manucol LM 10 % kereskedelmi fehér búzaliszt 5 0,25 % Manucol LM 10 % kereskedelmi fehér búzaliszt 6 1 % Manucol LM 10 % kaolin 7 0,25 % Manucol LM 10 % kaolin Az 1. példa szerint végzett ülepítés és szárítás után mir den esetben robusztus gyöngyöket kaptunk. Manucol LM nagy molekulasúlyú nagy mannuron: guluronsav maradék arányú alginát. Töltőanyag alkalmazása esetén előnyös nagy molekulasúlyú alginátot használni, a gél megfelelő szilárdságának biztosítása érdekében. Szabadalmi igénypontok 1, Eljárás orálisan adagolható immunogén kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy élő, betokozódott parazita protozoák szuszpenzióját hozzuk létre valamilyen gélképző anyagban, majd a szuszpenziót tömör géllé ; lakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélesedést kémiai úton idézzük elő. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
