192536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás l9-epidianemicin előálítására
1 192 53(3 2 rvált ismérvek: E. tenella esetében ezt O-tól 4-ig terjedő sérülési pontszámakkal fejezzük ki, az alábbi irodalomban leírtak alapján: Lynch J. E., „A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”, Am. J. Vet. Res., 22., 324—326. (1961.); más fajták esetében pedig 0-tól 3-ig terjedő pontszámokkal, a pontozási rendszer módosított változata alapján, amelyet Johnson J. és Reid W. H. írt le az alábbi munkájában: „Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chiks”. Exp. Parasit., 28., 30—36. (1970.). Az arányszámot úgy kapjuk meg, hogy minden kezelt csoport sérülési pontszámát elosztjuk a fertőzött kontroll sérülési pontszámával. Az állati takarmányok értékét általában közvetlenül az állat etetésével határoztuk meg. Az 1 197 826 számú angol szabadalmi leírás egy olyan in vitro bendő-módszert ismertet, amellyel a táplálékokban a mikroorganizmusok által létrehozott változások könynyen és nagy pontossággal mérhetők, és így az állati takarmány értékelhető. Ez a módszer egy olyan berendezés alkalmazását foglalja magában, amelyben az állatok emésztési folyamatai in vitro befolyásolhatók és figyelhetők. Az állati eledeleket, bendő-inokulumot és különféle növekedést serkentő anyagokat gondosan szabályozott körülmények között egy laboratóriumi egységbe helyezzük, majd onnan visszanyerjük: miközban a mikroorganizmusok emésztik a táplálékot, a bekövetkezett változásokat folyamatosan figyeljük és értékeljük. A bendő-folyadékban a propionsav-tartalam növekedése azt jelzi, hogy a táplálékkeverékben a növekedést serkentő anyagok megfelelően befolyásolták a kérődzők táplálékhasznosítását. A propionsavtartalom változása a kontrollcsoport bendő-folyadékában talált propionsavtartalom százalékában van kifejezve. A bendő-folyadék propionsavtartalmának növekedése, és a megnövekedett tápanyaghasznosítás közti kölcsönhatás megbízható kimutatására hosszú időtartamú in vivo etetetési vizsgálatok szolgálnak. A vizsgálatban bendő-folyadékot gyűjtenek egy olyan sipolyozott tehénből, amelyet normálisan hizlaló táplálókkal és szénával etetnek. A bendő-folyadékot rögtön átszűrik egy sajt-vásznon, és 10 ml-t tesznek belőle egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 400 mg standard táptalajt (68% kukoricakeményítő + 17% cellulóz + 15% extrahált szójaliszt), 10 ml 6,8 pH-értékű puffert és a vizsgálandó vegyülateket tartalmazza. A lombikot oxigénmentes nitrogéngázzal telítik körülbelül 2 percig, majd egy rázott vízfürdőn körülbelül 16 óra hosszat linkubálják 39 °C hőmérsékleten. Minden vizsgálatot háromszor megismételnék. Az inkubálás után a minta 5 ml-ét 1 ml 25°/» -os metafoszforsavval összekeverik. 10 perc után 0,25 ml hangyasavat adnak hozzá, és a keveréket 1500 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugálják. A mintákat ezt követően Kellog D. W. (j. Dairy Science, 52., 1690. /1969./) módszere szerint gáz-folyadék kromatográfiával analizálták. A csúcsok magasságát ecetsav, propionsav és vaj sav esetében kezeletlen és kezelt inkubációs lombikokból származó minták alapján határozzák meg. A tápanyaghasznosítás megjavítása céljából a 19-epi-dianemicint bekeverhetjük az állatok — kérődzők, így szarvasmarha, kecske, egygyomrúak, így disznó, nyúl — táplálékába szabad sav, nátriumsó, káliumsó, vagy ezek keveréke formájában. A nyers 19- -epi-dianemicin vagy az antibiotikumot tartalmazó megszárított fermentációs (táptalaj természetesen szintén belekeverhető a táplálékba, a kívánt hatékony koncentrációban. Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást szemléltetik anélkül, hogy bejelentésünk oltalmi körét ezekre a példákra korlátoznánk. 1. példa Rázólombikba az alábbi közeget helyezzük: CL13M q'liter Keményítőcukor 20,0 Szójaliszt 10,0 Desztilláló oldható maradéka 5,0 Nátrium-szulfát 0,5 Kobalt-klorid 0,002 Kalcium-karbonát 2 A „desztilláló oldható maradéka” szerves nitrogénforrás, amelyet úgy állítanak elő, hogy a cefre desztillációj akar kapott fenékterméket leszűrik és a szűrletet szárazra párolják. A közeg 100 ml-ét 300 ml-es rázólombikba töltjük és 120 °C hőmérsékleten 100 kPa nyomáson 30 percig sterilizáljuk. Lehűtés után a közeget ATCC 172 agar közegen tenyésztett Streptomyces hygroscopicus ATCC 39205 vegetatív sejtszuszpenziójával oltjuk be. A lombikokat 28 °C hőmérsékleten, körforgó rázógépben rázzuk 3—4 napig. A gép elmozdulása percenként 3,8—6,3 cm és 150—200 körfordulat (CPM). Egy lombik tartalmával egy 5-literes fermentort oltunk be. A fermentor 3 liter alábbi összetételű közeget tartalmaz: CL13M g'liter Keményítőcukor 20,0 Szójaliszt 10,0 Desztilláló oldható maradéka 5,0 Nátrium-szulfát 0,5 Kalcium-karbonát 2.0 Kobalt-klorid 0,002 Víz 1 literhez pH = 6,9—7,0 Habzásgátló szerként 1 ml L61 szilikont adunk hozzájuk, majd a fermentáló edényeket lezárjuk és 120 °C hőmérsékleten, 100 kPa nyomáson 45 percig sterilizáljuk óikét. Az edényeket egy lombik tartalmával (körülbelül 3% inökulum) beoltjuk, 96—168 óráig 30 °C hőmérsékleten fermentáljuk, 1700 fordulat/perc (RPM) sebességgel keverjük, a levegőztetés sebessége percenként 1 térfogat le5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
