192461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BBM-2478 antibiotikum komplexnek és komponenseinek a BBM-2478A és BBM-2478B antibiotikumoknak, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására
1 192461 2 készítésnél szokásos vivőanyaggal/anyagokkal összekeverjük, és a keveréket önmagában ismert módon gyógyászati készítménnyé alakítjuk. Az antibakteriális hatású gyógyászati készítmények a vivőanyag(ok) mellett antibakteriálisan hatékony mennyiségű BBM—2478A vagy BBM—2478B jelű vegyületet tartalmaznak. A daganatellenes hatású gyógyászati készítmények a vivőanyag(ok) mellett hatékony daganatgátlást biztosító mennyiségben tartalmazzák a BBM—2478A jelű vegyületet. Előnyösen parenterálisan beadható gyógyászati készítményeket állítunk élő. A parenterálisan beadható gyógyászati készítmények steril vizes vagy nem vizes oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. Előállításuk közvetlenül beadás előtt is történhet steril, szilárd készítményből, amelyet steril vízben, fiziológiás sóoldatban vagy más steril befecskendezhető folyadékban oldunk. A BBM—2478A és B jelű vegyületből alkalmazott tényleges mennyiség általában függ az illető vegyülettől, az alkalmazott gyógyászati készítménytől, a beadás módjától, továbbá a kezelt személy vagy állat állapotától és betegségétől. A gyógyszer hatását befolyásoló számos tényezőt a szakember figyelembe tud venni. Ilyen például a kezelt személy életkora, testsúlya, neme, étrendje, a beadás ideje, módja, a kiürülés sebessége, a kezelt személy állapota, az esetleg szintén használt másmilyen gyógyhatású vegyidet, érzékenység és a betegség súlyossága. A kezelést végezhetjük folyamatosan vagy szakaszosan, betartva a maximális elviselhető dózist. A fenti útmutatások alapján, ismert dózismeghatározó tesztek alkalmazásával a szakember könnyen megállapíthatja az adott körülmények között alkalmazandó optimális dózist. A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. A példákban szereplő Amberlite CG—50 gyengén savas, karbonsavtípusú kationcserélő gyanta, a Rohm and Haas Co., {Philadelphia, Amerikai Egyesült Államok) védjegyzett terméke. A Diaion HP—20 nem ionos makroretikuláris polimer gyanta, a Mitsubishi Chemical Industries {Japán) védjegyzett terméke. 1. példa A BBM—2478A és B jelű vegyüíet előállítása fermentálással A J907—21 jelzésű actinomycete törzs jól fejlett ferde tenyészetével beoltottuk az alábbi összetételű vegetatív táptalajt: 3% oldható keményítő, 1% Bacto-máj (Difco), 0,5% halliszt, 0,3% nátriumklorid, 0,1% ammóniumszulfát és 0,6% kalciumkarbonát. Sterilizálás előtt a pH értékét 7,0-re állítottuk be. A vegetatív táptalajt 72 órán át inkubáltuk 28 °C-on forgó rázógépen, 250 fordulat/perc beállításával. A képződő tenyészet 5 ml mennyiségét 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba vittük át, amely 100 ml fermentáló táptalajt tartalmazott. Ennek összetétele megegyezett a vegetatív táptalajéval. A fermentálást a forgó rázógépen végeztük 28 °C hőmérsékleten, 7—10 napig. A fermentlében levő antibiotikumok aktivitását papírkorongos agar-agar diffúziós módszerrel határoztuk meg, Micrococcus luteus PCI 1001 mikroorganizmust használva a vizsgálathoz. 6—7 napig végzett fermentálás után lett maximális hatékonyságú az antibiotikum képződése (150 mikrogramm/milliliter). 2. példa A BBM—2478A és B jelű vegyületek elkülönítése és tisztítása Az 1. példa szerint kapott 20 liter mennyiségű, pH = 6,8 értékű fermentlét Sharpless típusú centrifuga {Kokusan No. 4A) segítségével micéliumra és felülúszó folyadékra választottuk szét. A micéliumot háromszor extraháltuk 5—5 liter metanollal. Szűrés után a metanoios extraktumokat egyesítettük, és vákuumban bepároltuk. Így vizes oldat maradt vissza. A f ermentlé centrifugálásakor elválasztott felülúszó folyadékot 20 liter n-butanollal extraháltak, az extraktumot vákuumban bepároltuk. Vizes oldat maradt vissza, amelyet egyesítettünk a másik vizes koncentrátummal, és 5,5 cm átmérőjű, 60 cm magasságú Diaion HP—20 oszlopra vittük fel. Az oszlopot egymás után eluáltuk 5 liter vízzel, 5 liter 50%-os vizes metanollal és 6 liter 80%-os vizes metanollal. Papírkorongos vizsgálattal, Bacillus subtilis M45 (Rec~) alkalmazásával állapítottuk meg, hogy melyik frakciók tartalmazzák a BBM—2478 jelű vegyületeket. Ezeket az aktív frakciókat, amelyeket a 80%-os vizes metanollal végzett elúcióval kaptuk, egyesítettük, csökkentett nyomáson bepároltuk, a maradékot pedig fagyasztva szárításnak vetettük alá. Ilyen módon 4,5 g sárga szilárd anyag alakjában kaptuk a nyers BBM— 2478 komplexet. Ezt a nyers terméket 3,5 cm átmérőjű, 55 cm magasságú, előzetesen kloroformmal átmosott szilikagél oszlopra vittük fel, majd kloroform és metanol elegyével éluáltuk, miközben szakaszosan növeltük a metanolkoncentrációt (5—10 térfogat%). Az 5%-os metanollal eluált első aktív frakciókat vákuumban bepároltuk, és a maradékot liofilizáltuk Ilyen módon 72 mg BBM— 2478B jelű vegyületet kaptunk; op.: 271—272 °C (boml.). Hasonló módon dolgoztuk fel a 10%-os metanollal eluált második aktív frakciókat. Ezekből 2,51 g félig tiszta, szilárd BBM—2478A jelű vegyületet kaptunk. Ez utóbbit további kromatografálásnak vetettük alá szilikagélen, közepes nyomású folyékony kromatogram alkalmazásával (11 mm átmérőjű, 500 mm magasságú Kiriyama-oszlop, FMI laboratóriumi szivattyú, 80— 90 psi nyomás). Az elúciót 97 térfogatrész kloroform és 3 térfogatrész metanol elegyével vé5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
