192401. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid-antibiotikumok előállítására
1 2 elején, majd 24 és 48 órával később minden egyes lombikhoz 4 mg cerulenint adunk az adalékanyagot kevés etanolban oldva. A tenyésztés 24. órájában ezenkívül minden egyes lombikhoz 10 mg protüonolidot adunk, kevés etanolban oldva az anyagot. A tenyésztést 72 órán át folytatjuk, miközben a pH értékét nem szabályozzuk. 100 Sakaguchi lombikban levő fermentléből kiszűrjük a cspadékot és a sejttömeget, így 8.5 liter szűrletet kapunk. A szűrlet pH-ját 6 N nátrium-hidroxid oldattal 8.5-re állítjuk, majd kétszer extraháljuk azonos mennyiségű benzollal. A benzolos fázist szárazra párolva 1.3 g sárga port kapunk. Ezt a port kloroformban szuszpendáljuk, majd szilikagéllel (Merck 7734) töltött oszlopra visszük és kloroform/metanol/tömény vizes ammónia 10/1/0.05 arányú eleggyel eluáljuk. 20 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik frakciót szilikagél vékonyréteg kromatográfiával (Merck 5554, kifejlesztő oldószerklorofoím/metanol/tömény vizes ammónia 15/1/0.05 arányú elegye) vizsgálva azonosítjuk a körülbelül Rf= =0.26 értékkel rendelkező anyagot tartalmazó frakciókat. Ezeket a frakciókat egyesítjük, majd csökkentett nyomáson bepárolva 96 mg keveréket kapunk a PTL- 448-A és PTL-448-B jelű vegyületekből, fehér por formájában. Ezeknek az anyagoknak az elválasztására alumínium-oxid vékonyréteg kromatográfiát végezünk (Merck 5550,kifejlesztő oldószer etilacetát/benzol 6/1 arányú elegye). A 0.6 és 0.4 Rf értékű sávokat összegyűjtjük, etilacetáttal kioldjuk, majd bepároljuk, így 37 mg PTL-448-A Rf 0,6, illetve 45 mg PTL448- B (Rf 0,4) anyagot kapunk, fehér por formájában. A PTL-448 anyagok fizikai kémiai tulajdonságait az 1., valamint 2(A) és 2(B) táblázatban mutatjuk be. 2-4. példák Az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy protilonolid, a tenyésztés első napja után adagolandó kiindulási anyag helyett 5-0- -mikaminazolil-protilonolidot, 20-hidroxi-5-0-mikaminazil-protilonolidot vagy 20-oxo-5-0-mikaminozil-protilonolidot adagolunk, mindegyik anyagot 15 mg/lombik mennyiségben. A tenyésztés megkezdése után három nappal PTL448-A és -B keletkezik és halmozódik fel a tenyészlében, a 3. táblázat-ban bemutatott mennyiségben. A mennyiség meghatározását úgy végezzük, hogy a tenyészlevet benzollal extraháljuk, akívánatot bepároljuk, a maradékot metanolban oldjuk, majd az 1. példa alapján a maradékot vékonyréteg kromatografiával választjuk szét és tisztítjuk, alumíniumoxid/szilikagél-en, páasztázó UV-vel 232 nm-en. 3. táblázat Példa Kiindulási anyag PTL448 mennyisége A (/mi/mgl) 2. 5-o-Mikaminozilprotilonolid 10 11 3. 20-Hidroxi-5-0-mikaminozil-protilonolid 5 8 4. 20-OXO-5 -0-mikaminozil-protilonolid 19 20. 5. példa Az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a Streptomyces ambofaciens STCC 23877 törzset használjuk oltóanyagként. Ennek eredményeképpen úgy találtuk, hogy 1.2 /ig/ml PTL-448-A és 3.5 jug/ml PTL-448-B keletkezik és halmozódik fel a tenyészlében. Az 1. példában szereplő törzset hasonló kísérletben alkalmazva 15 pg/ml PTL448-A és 21 ng/ml PTL448-B keletkezik. 6. példa 100 milligram PTL-448-A vegyülétet oldunk 5 ml sósavval savanyított metanolban (pH 2) majd 2 órán át 42 °C-on kevertetjük. A reakció-elegy pH-ját 9-re növeljük nátrium-hidroxiddal, majd az oldatot benzollal extraháljuk. A maradékot kevés metanolban, oldjuk, majd vékonyréteg-kromatográfiát végzünk vele (szilikagél, kifejlesztő keverék a kloroform/metanol/tömény vizes ammónia 10/1/0.05 arányú elegye). A körübelül 0,4-es Rf értékkel rendelkező terméket kinyerjük, majd besűrítjük, így 45 mg PTL-448-C vegyületet kapunk fehér por formájában. Ennek az anyagnak a fizikai-kémiai tulajdonságait az 1. táblázatban mutatjuk be. 7. példa 5 milliméter, 20 mg PTL448-A vegyületet tartalmazó, 0.1 N sósav/metanol 1/3 ele gyet szobahőmérsékleten éjszakán át kevertetjük. Benzollal való extrahálás után, a 6. példában szereplő eljárást alkalmazva 8.4 mg PTL448-C vegyületet kapunk. 8. példa A 6. példában szereplő eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy 100 mg PTL448-B vegyületet oldunk 15 ml, sósavval pH-2-re savanyított metanolban. így 41 mg fehér por formájú PTL-448-D vegyületet kapunk. Ennek az anyagnak a fizikai-kémiai tulajdonságait az 1. táblázatban mutatjuk be. A kísérő rajzok között az 1. ábra mutatja a PTL- 448-A UV elnyelési spektrumát (metanolban), a 2. ábra a PTL448-A infravörös elnyelési spektrumát (kálium-bromidban), a 3. ábra a PTL448-A proton mag-mágneses rezonancia spektrumát (CDCl3-ban), a 4. ábra a PTL448-B UV elnyelési spektrumát metanolban), az 5. ábra a PTL448-B infravörös elnyelési spektrumát (kálium-bromid módszer), a 6. ábra a PTL448-B protonmágneses rezonancia spektrumát (CDCl3-ban), a 7. ábra a PTL448-C UV elnyelési spektrumát (metanolban), és a 8. ábra mutatja a PTL- 448-D UV elnyelési spektrumát (metanolban). A találmány szerinti PTL448 származékok mikroba-ellenes hatását a következő, 4. táblázatban mutat-Iuk be, mely számos, különböző tipikus baktériumokkal szemben meghatározott minimális gátló koncentrációt (MIC) -vizsgáló kísérlet eredményeit összegzi Spiramicin I-gyel és IlI-mal (SPM I és SPM III) kapott összehasonlító eredményeket is megadunk. A vizsgálatokat szív-infúziós agar táptalajon végeztük (pH 7,37 °C, körülbelül 20 óra inkubájás). 192,401 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5
