192390. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a hat-helyzetben heterociklusos vagy aliciklusos csoporttal helyettesített piridazin aminát származékainak és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítményeknek az előállítására
1 192.390 2 ból kristályosítás után). 3. példa 3- (MorfoUno-etil-amino)4-metil-6-ciklohexil-piridazin [CM 30390, olyan (I) általános képletű vegyület, amelynél R, jelentése ciklohexilcsoport és R3 jelentése metilcsoport] és dihidrokloridja Az 1. példában ismertetett módon eljárva, de egyik kiindulási anyagként 2-acetil-tiofén helyett ciklohexil-metü-ketont használva egymásután a következő vegyületeket kapjuk: 2- hidroxi-2-metü-6-(ciklohexil-karbonil)-propionsav; 4- metil-6-ciklohexil-3-piridazon (olvadáspontja 173 °C izopropanol és diizopropil-éter elegyéből kristályosítás után), hozam 68,6 % 3- klór-4-metil-6-ciklohexil-piridazin (szílikagélen eluálószerként 75 térfogat% etil-acetát és 25 térfogat % hexán elegyével végzett kromatografálás útján elkülönítve), hozam 52,3%, CM 30390 (sárga olaj), hozam 60,5% és dihidrokloridsó (olvadáspontja 237 °C izopropanol és dietíl-éter elegyéből végzett kristályosítás után). A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket különböző farmakológiai vizsgálatoknak vetjük alá abból a célból, hogy megállapítsuk hatásukat a központi idegrendszerre. 1) Antidepresszív hatás Reserpine-nel kiváltott ptózis antagonizálása Ezt a Gouret által a Journal de Pharmacologie, Paris 4(1), 105-128 (1973) szakirodalmi helyen ismertetett tesztet 20 i 1 g súlyú, Charles River CDI törzsbeli nőstény egereken hajtjuk végre. A reserpine (3,4, 5- trimetoxi-benzoil-metil-rezerpát; Merck Index, 8. kiadás, 912. oldal) intravénás beadása után 1 órával ptózist okoz; egyes antidepresszánsok megakadályozzák ezt a ptózist. A következő kísérleti módszert alkalmazzuk. A vizsgálandó anyagokat intraperitoneálisan adjuk be. Ezek beadásával egyidejűleg intravénás úton 2 mg/ kg dózisban beadjuk a reserpine-t is. Az utóbbi beadása után 1 órával a ptózist nem adó állatok számát feljegyezzük. A kísérletsorozatot 10-10 egérből álló csoportokon hajtjuk végre és a ptózist nem adó állatok százalékos arányát meghatározzuk. Az eredményeket EDS0- ként, vagyis a kezelt állatok 50%-nál a ptózist megelőző dózisként adjuk meg. 5-Hidrox/-triptofán által kiváltott fe/rángás potencializá/ása Az 5-hidroxi-triptamin prekurzora, az 5-hidroxi-triptofán egereknél olyan jellegezetes viselkedést okoz, amelyre hirtelen fejrángások jellemzők. Növelik a fejrángások számát azok a molekulák, amelyek aktiválják a centrális szerotoninergikus átvitelt, míg a triciklusos antidepresszánsok inaktívak. Zéró időpontban intraperitoneálisan a k bérleti vegyületet, majd 1 órával később ugyanígy egyetlen, 200 mg/kg nagyságú dózisként L-5-hidroxi-triptofán desztillált vízzel készült szuszpenzióját adjuk be. Mindegyik kísérleti állatot (22-24 g súlyú, Charles River CDI törzsbeli nőstény egerek) azonnal hengeralakú üveg főzőpohárba helyezzük. A fejrángások számát 20 percen át számoljuk. A kísérleti vegyületek mindegyik vizsgált dózisához 10-10 állatból álló kísérleti csoportokon végezzük el a kísérletet, csak a hordozóanyaggal kezelt kontrollcsoporttal összehasonlításban. A kapott eredményeket a kontrollcsoportnál kapott átlagos eredmény százalékában fejezzük ki. Az in vitro MAO-A aktivitás vizsgálata A monoamin oxidáz A (MAO-A) hatására kifejtett gátló hatást a Kan és munkatársai által a Life Sciences, 26, 2165-2171 (1980) szakirodalmi helyen ismertetett módszenei értékeljük, az említett enzim forrásaként patkány-striatumot használva. Disszekció után a szöveteket egy súlyrésznyi mennyiségükre vonatkoztatva 16 térfogategységnyi 0,1 mólos, 7,40 pH-értékű jéghideg foszfát-pufferrel homogenizáljuk, majd az így kapott homogenizátumból 0,1 ml-es frakciókat 10 percen át inkubálunk 14C-gyel jelzett 5-hidroxi-triptamin (végső koncentrációja 480 juM) és a kísérleti vegyület különböző mennyiségeinek jelenlétében, amikor az inkubált elegy össztérfogata 0,5 ml. A savas metabolitokat toluol és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyéből 7-7 rnl-rel extraháljuk, majd folyadékszcintillációs mérésr ek vetjük alá. A kísérleti vegyületnek kontroll aktivitást 50%-ban gátló koncentrációját, azaz az IC50 értéket grafikusan határozzuk meg. 2) Dopaminergikus hatás Ezt a hatást a striatum unilaterális (egyoldali) megsértése után a forgási viselkedés analízise útján vizsgáljuk. A vizsgálat alapját a Protais, P. és munkatársai által a J. Pharmacol, 7.251 (1976) szakirodalmi helyen közöltek képezik. A kísérletek megkezdése előtt 20-24 g súlyú, Charles River CDI törzsbe tartozó nőstény egereknél a striatumot unilaterális megsértésnek vetjük alá 6- -hidroxi-dopamint sztereotaxikusafl injektálva 8 mg /allat arányban. Ezután az operáció után egy héttel a vizsgálni kívánt vegyületeket 7-7 egérből álló kísérleti csoportoknak adjuk be intraperitoneálisan. A viszgálandó vegyület beadása után 1 órával a forgások számát 2 percen át megállapítjuk. A sérülésre vonatkoztatva azonos oldalon végbemenő forgásokat pozitiven, míg az ellentétes oldalon végbemenő forgásokat negatívan számoljuk. A kezelt állatok egy adott csoportjánál végbemenő forgások algebrai összegét összehasonlítjuk a csak hordozóanyaggal (fiziológiás szérum) kezelt kontrollállatok csoportjánál végbemenő forgások algebrai összegével. Az eredményeket a kezelt állatoknál végbemenő forgásoknak a kontrollállatoknál végbemenő forgások hoz viszonyított százalékában fejezzük ki. 3, Kolinergikus hatás A muszkarinikus típusú kolinerg receptorok jelezhetők in vitro triciált kinuklidinil-benziláttal (QNB[3Hj). Az ilyen jelzés a Yamamura és munkatársai által a Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 71,1725-1729(1974)szakirodplmi helyen ismertetett technika szerint hajtható végre. A kisagy eltávolítása után patkányok nagyagyát egy súlyrésznyi mennyiségükre vonatkoztatva tízszeres mennyiségű 0,32 mólos szacharóz-oldattal homogenizáljuk, majd a homogenízátumot 1000 g-nél 10 percen át centrifugáljuk. A koncentrátumot elimináljuk, míg a felülúszót újból homogenizáljuk. Az így kapott anyagból 0,1 ml-es aliquot frakciókat 25 c-on 1 órán át inkubálunk 2 ml., különböző mennyiségekben kísérleti vegyületet és 0,05 nM QNB[3H ]-t tartalmazó 0,05 mólos, 7,4 pH-jú foszfátpufferben. A mintákat ezután a Whatman amerikai cég által szállított GF/B jelzésű szűrőn szűrjük csökkentett 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
