192272. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kondenzált diazepinonok előállítására
1 192 272 2 „In vitro" szervpreparátumok Tengerimalac csípőbelén és elektromosan stimulált pitvarán „in vitro” meghatároztuk a disszociáció-állandókat (KB-értékek). A csípőbelet kivettük és szervfürdőben, Tyrode-oldatban inkubáltuk. A kontrakciókat Bethanechol (B) növekvő koncentrációival úgy idéztük elő, hogy teljes koncentráció-hatásgörbéket tudtunk felvenni. Ezután a (B) anyagot kimostuk, a vizsgálandó vegyületet a preparátumhoz adtuk és 2 percig azzal érintkezésben hagytuk, majd a (B) anyaggal a koncentrációhatásgörbét újra felvettük. A dózisarányból, ami a koncentráció-hatásgörbe eltolódásának a mértéke, a disszociációállandót Arunlakshana és Schild szerint [Brit. J. Pharmacol., 14, 48 (1959)] számítottuk ki. Az izolált, elektromosan stimulált bal pitvaron a (B) anyag a koncentrációtól függően csökkentette a kontrakció erejét. Egy antimuszkarin hatású anyag hozzáadása ezt a hatást ismét megszüntette. A pitvar muszkarin-receptoraira vonatkozó disszociációállandókat a fentiekkel azonos módon kaptuk meg. A kétféle szövetben megállapított disszociációállandók összehasonlítása lehetővé tette a kardioszelektív anyagok megállapítását. „In vivo" eljárások Az alkalmazott eljárások célja az antimuszkarin hatás szelektivitásának a megállapítása volt. Azokkal a vegyületekkel, amelyeket az „in vitro” kísérletek alapján kiválasztottunk a következő vizsgálatokat végeztük : 1. tachikardia-hatás nem altatott kutyán, 2. gyomorsavkiválasztást gátló hatás patkányon, amelynél a pylorust elkötöttük, és 3. pupillatágító hatás patkányon. 1. Szívfrekvenciát fokozó hatás nem altatott kutyán Az anyagokat intravénás injekcióban adtuk be, és a szívfrekvenciát tachigráffal mértük. Bizonyos kontroli-időtartam után a szívfrekvencia fokozására beadtuk a vegyület növekedő dózisait. A következő dózist mindig akkor injekcióztuk be, amikor az előző dózis hatása már nem volt észlelhető. Az anyagoknak azt a dózisát, amely 50 szíwerés/perc növekedést idézett elő (ED50) grafikusan állapítottuk meg. Minden anyagot 3-5 kutyán vizsgáltunk meg. 2. Kiválasztást gáltó hatás patkányon Az alkalmazott eljárást Shay és munkatársai ismertették [Gastroenterology, 26, 906 (1954)]. 5 perccel a pylorus elkötése előtt hím Wistar-patkányokba az anyagok növekvő dózisait injekcióztuk intravénásán. Egy csoportban 10 patkány volt. A patkányokat 2 órával később leöltük és a gyomomedv térfogatát, valamint az „Acid Output”-ot titrálással meghatároztuk. Az anyagoknak azt a dózisát, amely a térfogatot vagy az „Acid Outputot 50%-kai csökkentette, grafikusan meghatároztuk. 3. Pupillatágító hatás patkányon A pupillatágulatot (mydriasis) a kísérleti anyagok intravénás injekciózása után, a pupillanagyság növekedésének mérésével határoztuk meg. A pupillanagyság mérését mikroszkóppal végeztük. A méréseket az anyagok különböző dózisainak injekciózása után különböző időkkel (15, 45 és 75 perc) végeztük. Az eredményeket az ED200-zal fejeztük ki. Ez azt a dózist jelenti, amely az alapértékre vonatkozóan a pupilla átmérőjét a kétszeresére növeli. A maximális hatást, általában 15-45 perccel az intravénás beadás után észleltük. B. Kötési tanulmányok muszkarin-receptorokon Az IC50-érték meghatározása Szervdonorként 180-220 g testsúlyú hím Sprague-Dawley patkányok szolgáltak. A szív, a gyomor és az agykéreg eltávolítása után az összes további műveletet jéghideg Hepes-HCi-pufferban (pH = 7,4; 100 mmólos NaCl, 10 mmólos MgCl2) végeztük. A teljes szívet ollóval felaprítottuk. Valamennyi szervet ezután edényben homogenizáltuk. A kötési kísérlethez a szervhomogenizátumokat a következőképpen hígitottuk: teljes szív 1 : 250 agykéreg 1 : 3000 A szervhomogenizátumokat a radioligandum meghatározott koncentrációjával és a nem-radioaktív kísérleti anyagok koncentrációsorozatával Eppendorf-féle centrifuga-csövekben 30 °C-on inkubáltuk. Az inkubáció időtartama 45 perc volt. Radioligandumként 0,3 nmólos 3H-N-metil-szkopolamint (3H-NMS) használtunk. Az inkubáció után az inkubált anyagot 14 000 g-nél centrifugáltuk, és a radioaktivitást a kicentrifugált részben meghatároztuk. Ez a 3H-NMS specifikus és nemspecifikus kötésének az összegét képviseli. A nemspecifikus kötés az a radioaktivitás, amely 1 pmólos kinuklidin-benzilát jelenlétében megköt. Mindig négy meghatározást végeztünk. A nem-jelzett kísérleti anyagok IC50-értékeit grafikusan meghatároztuk. Ez a kísérleti anyagnak az a koncentrációja, amely a 3H-NMS specifikus kötését a különböző szervek muszkarin-receptoraira 50%-kal gátolja. A fenti eljárásokkal például a következő vegyületeket vizsgáltuk meg: A = ll-{[2-[(Dietil-amino-metil)-piperidino]-acetií]-5,ll-dihidro-6H-pirido [2,3-b] [1,4] benzodiazepin-6-on B = 5,11-dihidro-l l-[(4-metil-piperazino)-acetil]- 6H-pirido [2,3-b] [1,4] benzodiazepin-6-on (Pirenzepin) C = atropin D = 5,11-dihidro-l l-{[2-(dimetil-amino-metil)-piper.dino]-acetil}-6H-pirido [2,3-b] [1,4] benzodiazepin-6-on E = 5,11-dihidro-l 1 -{[2-(2-dimetilamino-etil)piperidino]-acetil}-6H-pirido [2,3-b] [1,4] benzodiazepin-6-on F = 5{2-(dietil-amino-metil)-piperidino]-acetil}-5,10-c'ihidro-llH-dibenzo [b, ej [1,4] diazepin-11- -on G = 4-{[2-(dietil-amino-metil)-piperidino]-acetil}-4,9-difiidro-lOH-tieno [3,4-b] [1,4] benzodiazepin- 10-on 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
