192162. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 47934 jelű antibiotikum előállítására
1 192 162 2 főszerepet játszik az összemésztési folyamatokban, és amelyek számára ezek az antibiotikumok különösen kedvező hatásúak. Az A 47 934 jelű antibiotikumot a Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 vagy ennek A 47 934-et képző mutánsa vagy változata termeli, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó süllyesztett kultúrában, aerob körülmények között tenyésztve a mikroorganizmust addig, amíg lényeges mértékű antibiotikum aktivitást nem jelenik meg. Miként más mikroorganizmusok esetében is, az A 47 934 jelű antibiotikumot termelő kultúra, azaz az NRL 15 009 törzs tulajdonságai változnak. A találmány szerint felhasználhatók az NRRL 15 009 törzsnek A 47 934 jelű antibiotikumot termelő természetes variánsai és mutánsai (spontán vagy indukált). Számos különféle táptalaj használható a Streptomyces toyocaensis-szei történő A 47 934 jelű antibiotikum termelésére. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a könnyű termékizolálás szempontjából azonban bizonyos táptalajok előnyösebbek. Ezeknek a táptalajoknak asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat kell tartalmazniuk. Alkalmas szénforrás a glükóz, burgonya dextrin, tápióka dextrin, keményítő és melasz. Alkalmas nitrogénforrás a szójadara, savhidrolizált kazein, marhahúsextraktum és szójaliszt. A növekedéshez és fejlődéshez szükséges eszenciális nyomelemeket a mikroorganizmus a kukoricalekvárból kaphatja meg és a növekedésnek és a bioszintetikus igényeknek megfelelő mennyiségben szennyezésként előfordulhatnak a táptalaj egyéb alkotórészeiben is. Kedvező hatású lehet azonban, ha a táptalajt nátrium, kálium, magnézium, kalcium, ammonium, klorid, karbonát, foszfát, szulfát, nitrát és más ionokat szolgáltató oldható tápsókkal egészítjük ki. Az NRRL 15 009 törzzsel történő érdemleges mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikum termeléséhez tartályokban végzett, süllyesztett aerob fermentációt használunk. Kis mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikumhoz rázott lombiktenyészetben is hozzájuthatunk. A tartályban végzett fermentálásnál előnyös a vegetatív inokulum használata. A vegetatív inokulum elkészítéséhez kis térfogatú táptalajt oltunk be spórával, micélium fragmensekkel vagy liofilizált mikroorganizmussal, hogy friss, aktívan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív inokulumot aztán a nagy tartályba visszük át, ahol megfelelő inkubációs idő után optimális mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikum termelődik. A be nem oltott táptalaj az összetételtől függően változó kémhatású, de valamennyi 6,4-7,0 pH tartományba esik. Ez az A 47 934 jelű antibiotikumot termelő mikroorganizmus 20-40 *C közötti széles hőmérsékleti tartományban tenyészthető. Az NRRL 15 009 törzzsel történő A 47 934 jelű antibiotikum termelés optimális hőmérséklete 30 °C körűi van. Amint az a süllyesztett aerob tenyészeteknél szokásos, steril levegőt diszpergálunk a tenyészeten keresztül. A mikroorganizmus eredményes növekedéséhez a tartályban történő fermentálásnál használt percenkénti levegőtérfogat a lenyészlé térfogatának 0,1-0,5 részével egyenlő. Egy 165 literes fermentornál a szokásos percenkénti 250 fordulatszámú keverés mellett az optimális percenkénti levegőtérfogat a tenyészlé térfogatának 0,25 részével egyenlő. Amennyiben a habzás gondot okozna, kis mennyiségű (azaz 0,2 ml/l) habzásgátló anyagot, például propilénglikolt adhatunk a nagytérfogatú fermentléhez. Az A 47 934 jelű antibiotikum termelődésének fermentáció alatti nyomonkövetését agardiffúzíós, azaz biometriás méréssel vagy turbidimetriás módszerrel végezhetjük. Az alkalmazott teszt-organizmus a Bacillus subtilis ATCC 6633. Mérés előtt a minta kémhatását pH 10,5-re állítjuk vizes nátriumhidroxid oldattal és lecentrifugáljuk. Az antibiotikus aktivitás rendszerint a 36. óra után jelenik meg és legalább hét vagy több napig megmarad a fermentációs periódus alatt. Az antibiotikum-termelés maximuma a 4-5 napos fermentációnál jelenik meg. Az A 47 934 jelű antibiotikumot az e területen alkalmazott módszerekkel nyerhetjük ki a fermentléből. Minthogy az A 47 934 jelű antibiotikum legnagyobb része a sejten vagy a sejtben adszorbeált, a sejtből való felszabadítás céljából a fermentlé kémhatását lúggal, például nátriumhidroxid vizes oldatával pH 10,5-re állítjuk. Szűrő-segédanyagként diatómaföldet (Hyflo Super-cel, Johns Manville Corp.) adunk a fermentléhez, összekeverjük és szűrjük, célszerűen szűrőprést alkalmazva. Az antibiotikumot tartalmazó szűrletet pH 7,0 kémhatásra állítva semlegesítjük és Diaion HP-20-szal (nagy porozitású sztirol-divinilbenzol gyöngy kopolimer, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japán) kevertetjük kb. 60 percen keresztül. A vizes fázist leszívatással vagy szűréssel választjuk el a gyantától, mely adszorbeálta az antibiotikumot. Más adszorbensek is ismertek e téren, például a szén, a szilikagél, a poliamid, az alumíniumoxid, a makroretikuláris gyanták (XAD-2, XAD-4 stb.) és az ioncserélő, elsősorban anioncserélő gyanták. Az A 47 934 aktivitás adszorbeált Diaion HP-20 gyantát vízzel, majd víz-metanol 4 : 1 arányú keverékével mossuk és szűrjük. Az antibiotikumot, eluensként víz-metanol 1 : 1 arányú keverékét használva oldjuk le a gyantáról. Az eluátumot bekoncentrálva és liofilizálva, halvány barna színű nyers A 47 934 port kapunk, amit tovább tisztíthatunk ismert kromatográfiás eljárásokkal. A fermentlészűrletből is kinyerhetjük az antibiotikumot, savval kb. pH 3-ra állítva a szűrlet kémhatását a teljes lecsapódáshoz, majd a csapadékot kiszűrjük. Az A 47 934 jelű antibiotikum pH 6,5- nél kezd lecsapódni és pH 3-nál a lecsapódás teljes. A lesavanyításhoz szervetlen savak, például sósav, kénsav és foszforsav, valamint szerves savak is, például ecetsav és hangyasav alkalmasak. Az így kapott nyers A 47 934 jelű antibiotikumot tovább tisztíthatjuk ismert kromatográfiás eljárásokkal. A találmány teljesebb illusztrálása céljából az alábbi példákat adjuk meg. 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
