191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 2 bármelyikéből elkülöníthetjük. Ezenkívül a Nocardia, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora és Arthrobacter fajokból készített glükóz-izomerázok is alkalmazhatók. A Streptomyces sp. ATCC 21,175 kiváló glükóz-izomeráz forrás a jelen találmány szerinti eljárás céljára. Mint a korábbiakban említettük, előnyös lehet olyan glükóz-izomeráz enzim felhasználása, amelyik az ehelyütt ismertetendő eljárásban alkalmazott viszonylag magas hőmérsékleteken stabilitást mutat. Ilyen például a Bacillus stearothermophilus termelte glükóz-izomeráz, különösen pedig az ATCC 21,365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 és NRRL B-3682 jelű Bacillus stearothermophilust tartalmazó csoportokból kiválasztott törzsek termelte glükóz-izomeráz, továbbá az Ampullariellafélékhez tartozó mikroorganizmusok, mint Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata, és Ampullariella reguláris által (4,308,349 számú USA szabadalom), a Bacillus licheniformis által (41 213 sz. Európai szabadalmi bejelentés), valamint a 74 30588 sz. japán bejelentésben leírt fajták hőkedvelő változatai által termelt glükóz-izomeráz. A fent említett mikroorganizmusokon túlmenően jelen találmány számításba veszi ezek mutánsainak és variánsainak legtágabb értelemben vett felhasználását. Tekintve, hogy a glükóz-izomeráz az említett és egyéb más mikroorganizmusok sejtközi terméke, glükóz-izomeráz fonáshoz a sejtek egyszerű kinyerésével juthatunk. A sejtekből azután a glükóz-izomerázt ismert technikákkal, pl. sejt-autolízissel, hanghullámokkal való roncsolással választhatjuk el, és ismert, hagyományos tervezésű enzim-reaktorban hasznosíthatjuk. Előnyösen, a kémiailag stabilizált glükóz-izomerázt szokványos eljárásokkal inert hordozón rögzíthetjük, hacsak a kémiai stabilizálás következtében nem vált oldhatatlanná. Az enzimek rögzítésére használt anyagok és eljárások jólismertek, és számos közleményben ismertetésre kerültek, köztük Wang és munkatársaiéban (Fermentation et Enzyme Technology, John Wiley et Sons, Inc., New York, 1979, pp. 318-338), továbbá Kirk-Othmerében (Encyclopedia of Chemical Technology, 3. kiadás, John Wiley et Sons, Inc., New York, 1980,9. kötet, pp. 148— 172). A 28,885 számú ismételten kiadott amerikai szabadalmi leírás szerint kismennyiségű kobalt, mangán és magnézium kation és/vagy kénessav vízoldható sóinak mint nátrium-szulfit, nátrium-biszulfit, magnézium-szulfit, ill. magnézium-biszulfitnak a jelenléte csökkenti vagy gátolja a glükóz-izomeráz denaturálódását a művelet kivitelezése közben; e hatást is figyelembe vettük. A kívánt eredmény elérése céljából az szükséges, hogy a glükóz-tartalmú kiindulási lé szénhidrát koncentrációja 20 és 85 tömeg%, előnyösen 30 és 50 tömeg% közé essék. Az is kívánatos, hogy az izomerizáció 3-tól 8-ig terjedő, előnyösen 4-től 7-ig terjedő pH-értékű közegben játszódjék le, legjobb azonban, ha a pH 5 és 6.5 között van. Amennyiben az izomerizációs reakció során a pH értéke az előbb említett határok alá vagy fölé kerül, nemkívánatos melléktermékek, mint pszikóz, szerves savak, színanyagok, színes elővegyületek, fruktóz-dianhidridek és hasonlók keletkezése kerül előtérbe. Megállapítottuk, hogy a glükóz-izomeráz optimális aktivitásához tartozó pH-érték magas hőmérsékleten figyelemreméltóan lecsökken. A Streptomyces rubigenosusból termelt gliikóz-izomerázra nézve például 25 °C-on 8.6-92 pH-értéknél, 75 °C-on Ó.9-7.5 pH- értéknél, és 125 °C-on 5.6—6.2 pH-értéknél helyezkedik el az aktivitási optimum. Ezért amint az izomerizációs hőmérséklet emelkedik, a pH csökkenhet a maximális enzim-aktivitás fenntartása és a nemkívánatos melléktermékek elkerülése érdekében. A jelen találmány másik fontos jellemzője a glükóztartalmú kiindulási cukorlé és a kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz közötti érintkezési időtartam. Ezt az időtartamot 1 másodperctől mintegy 5 óra hosszáig terjedő intervallumban kell tartani; előnyös, ha az alsó és felső határ 30 másodperc és 1 óra körül alakul, de legelőnyösebb, ha a kontaktidő körülbelül 2, illetve 30 perc közé esik. E feltételekkel lesz a fruktóz szinip elfogadható minőségű. A kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz és a glükózt tartalmazó lé közötti előnyös kontaktidő nagymértékben függ attól a pH-értéktől, amelyen az izomerizációs reakciót vezetjük. Alacsonyabb pH-érték mellett hoszszabb kontaktidő engedhető meg anélkül, hogy a glükóz és fruktóz a megengedettnél nagyobb mértékben pszikózzá és egyéb,nemkívánatos bomlástermékké alakuljon. Magasabb pH-érték mellett rövidebb kontaktidő szükséges a pszikóz és színanyagok képződésének elkerüléséhez. A gyakorlatban azt az időt tekintjük effektiv érintkezési időnek, amelyet a glükóz-tartalmú szörp a reakció véghőmérsékletén vagy ahhoz közelálló értéken tölt el, mivel az előforduló cukorbornlási reakciók nem enzimatikus rk, és végbemennek akár érintkezik a reakcióelegy a glükóz-izomerázzal, akár nem. Emiatt, 90 °C feletti hőmérsékleten vezetett izomerizációs reakciók esetén fontos minimalizálni a glükóz lé kívánt izomerizálási hőmérsékletre melegítésének időtartamát (például úgy, hogy az izomerázzal való érintkezést közvetlenül megelőzően, vagy annak folyamán a reakcióelegyet gőzzel összekeverjük), és amint elértük a kívánt fruktóz szintet, gyorsan elválasztani az aktív izomeráztól, majd amilyen hamar csak lehet, lehűteni 90 C, előnyösen 70°C alá. Ha a kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz valamely oldható formáját alkalmaztuk, szükséges lesz inaktiválni az enzimet (például a pH oly mértékű csökkentésével, amely inaktiváló hatást gyakorol az izomerázra) még a hűtési lépés előtt, hogy elkerüljük a magas hőmérsékletű izomrrizáció folyamán keletkezett fruktóz glükózzá történő visszaalakulását, lévén az izomerizálási reakció természetesen reverzibilis. A glükóz fruktózzá alakításának maximális mértékét a glükóz és fruktóz közötti termodinamikai egyensúly határozza meg. az viszont attól a hőmérséklettől függ, amelyen az izomerizációí vezetjük. Glükóz és fruktóz egyensúlyi elcgycinek igen gondos elemzéséből az alábbi összefüggés adódott: F = 100K:(K+ 1) (1)-!”K ' T+TO -2-3005' (2) ahol F a glükóz és fruktóz összsúlyára vetített egyensúlyi fruktóz-koncentráció tömeg%-ban, T az a °C-ban kifejezett hőmérséklet, melyen a reakciót lejátszatjuk, K pedig a gliikóz/fruktóz egyensúlyi állandó. A glükóz-tartalmú szörp és az izomeráz közötti aktuá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
