191858. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil plurilamelláris vesiculumok előállítására
1 191 858 2 közegben nem bomlik szignifikánsan nagyobb mértékben annál az értéknél, mintha a közegben nártium-klorid is jelen lenne. Bár a magyarázatok erre a jelenségre teoretikusan, úgy tűnik, hogy a válasz a dipól effektusnak, és nem annyira a ka- 5 otropikus tulajdonságnak tudható be, mivel a guanidin, melynek szerkezete a karbamidhoz hasonló nem destabilizálja az SPLV-t (II. táblázat). Bár a guanidin is erősen kaotropikus, nem rendelkezik erős dipol-momentummal. 10 Az SPLV ammónium-acetáttal szemben szintén érzékenynek mutatkozik, míg az MLV-nél ez a jelenség nem figyelhető meg. (II. táblázat). Azonban sem az ammónium-ion (ammónium-klorid), sem az acetát-ion (nátrium- I5 acetát) nem okozza az SPLV destabilizálódását. Úgy tűnik, hogy nem az ion mag, hanem az ammónium-acetát polaritása felelős a bomlás indukálásáért. Kezdetben ezek az eredmények meglepőnek tűntek, mivel az SPLV jóval stabilabb az MLV- nél, mikor azokat testnedvekben, így szérumban vagy vérben inkubáltuk. Ezek a feltevések azonban elméletiek, és természetesen más magyarázatok is lehetséges. Amennyiben az SPLV stabili- 2& tása a membrán kettősrétegek egyedülálló szerkezetének tudható be, azaz a membrán lipidek poláris csoportjai orientált vízmolekulák felhőjével vannak hidratálva, vagy hidrátburokba vannak zárva, valószínű, hogy sok olyan molekula 30 létezik, amely megtöri vagy kölcsönhatásba lép ezzel a hidrátburokkal és ily módon meggyorsítja a membránszerkezet integritásának változásait és ily módon bomlást okoz. Az elméleti megfontolásoktól függetlenül az 35 SPLV karbamidban destabilizálódik, az eredmények azt demonstrálják, hogy az MLV és SPLV szerkezete között jellegzetes különbségek vannak. Ezek a különbségek a felhasználásra nagyon jól alkalmazhatók. Mint azt már említettük az SPLV a szem kezelésekor igen lassan bomlik. Feltételezhető, hogy ez a kívánt lassú hatóanyag leadás az SPLV könnynedvben történő destabilizálásánái hasonló módon történik. Szérumban az SPLV az MLV-nél stabilabb. A lipid vesiculumokat sok esetben intraperitoniálisan alkalmazzák, ilyen alkalmazás történik a brucellosis kezelésében. A kívánt hatás elérésére a vesiculumoknak megfelelő ideig stabilnak kell lenniük, addig az ideig, amíg a célsejtet vagy sző- 50 vetet el nem érik. A tojás lecitinből előállított SPLV-t és MLV-t szarvasmarha-embrió szérummal reagáltattuk, mely aktív anyagokat tartalmazott (II. táblázat). 37 °C hőmérsékleten 48 óra elteltével az SPLV kimutathatóan stabilabbnak mutatkozott, mint az MLV. Az SPLV in vivo adagolásának jellegzetességei Terápiás rendszerekben in vivo az SPLV szá- o0 mos jellegzetessége miatt különösen alkalmas vivőanyagként történő alkalmazásra. (A) Az SPLV a tisztítással szemben rezisztensnek mutatkozik. Valamely organizmus SPLV-vel történő kezelésekor mind a lipidek komponens 65 mind a beépített hatóanyag a szövetekben és a sejtekben megmarad. (B) Az SPLV előállítása során nyújtott hatású rendszert is képeznek. Az adagolás során az SPLV stabil és ugyancsak stabilnak mutatkozik a tárolás ideje alatt, továbbá a testnedvek jelenlétében, de in vivo adagolás során lassú bomlás tapasztalható, mélynek eredményeképpen a hatóanyag lassan oldódik ki, ily módon biztosítva a nyújtott hatást. (C) A beépülés magas szintje és a nagyfokú stabilitás következtében a kezelés során a hatóanyag effektiv dózisa szabadul fel. (D) Az SPLV előállítása nagyon gazdaságos, mivel a vesiculumok stabilitása feleslegessé teszi drága stabilizálószerek beépítését a kettős rétegekbe. Az alábbi kísérletek az SPLV néhány fenti jellegzetességét mutatják be helyi, a teszt állatok szemén történő kezeléskor. A kísérletek során felhasznált SPLV-t a fent leírtak szerint állítottuk elő azzal az eltéréssel, hogy a lipid kettősrétegeket és a hatóanyagot radioaktív jelzéssel láttuk el, abból a célból, hogy ezeket a komponenseket egy adott idő alatt a szemszövetekben figyelemmel kísérhessük. Az SPLV-t 1ÖÖ mg tojás foszfatidil-kolinból (EPC) és 100 mg gentamicin-szulfátból állítottuk elő. A lipid komponenst radioaktív jelzéssel láttuk el, oly módon, hogy nyomni menyiségben 12SJ-foszfatidil-etanolamint (12SJ=PE) építettünk be a kettősrétegekbe, a hatóanyagot a vizes fázisban 125J-gentamicin-szulfát (I25JGS) jelzéssel láttuk el. A beépítésre vagy a kapszulázásra nem került anyagok hatékony eltávolítása céljából az SPLV-t pufferrel többször átmostuk. Az SPLV-készítmény egy aliquot részét eltávolítottuk és a vizes fázisnak a szerves fázistól történő elválasztása céljából extraháltuk. Mindegyik fázis radioaktivitását megmértük és meghatároztuk a 125 J-PE:125J-GS [cpm (beütés/perc) a lipidfázisban : cpm a vizes fázisban) kezdeti arányát, mely az SPLV-be épült be. Az extrakciót az alábbiak szerint végeztük el: 0,8 ml 0,4 mólos vizes nátrium-klorid-oldatot, 1 ml kloroformot és 2 ml metilalkoholt homogén fázis kialakulásáig kevertünk. A keverékhez ezután 4 mikroliter radiojelzett SPLV-t adtunk. Az SPLV szerves fázisban és a vizes fázisban történő beoldódásakor a reakciókeverék, mely kezdetben zavaros volt, feltisztult. A fázisokat 1 ml 0. 4 mólos vizes nátriumklorid és 1 ml kloroform adagolásával és elkeverésével szeparáltuk és 2,800 x g/5 perc sebességgel centrifugáltuk. Mindegyik fázisból 1 ml-t kivettünk és a radioaktivitást (cpm-ben) mértük. ( A kezdeti arány: 125 J-PE:125 J-GS = 1.55:1.) Tizenöt darab Swiss Webster nőstény egeret 3 szem sérülésének megelőzése céljából fájdalomcsillapító szerrel kezeltünk és rögzítettünk. Mindegyik szembe a radiojelzett SPLV szuszpenzió egyenlő mennyiségű 2 pl térfogatú aliquotját adtuk lokálisan. Három állatból álló csoportot 1, 2, 3, 18 és 24 óra elteltével megöltünk. Kilenc 7
