191849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászati hatású vegyületek és ezeket tartalmazó készítmények előállítására új hromobacterium violaceum törzs felhasználásával
17 191849 18 juk. Az Így sótalanított Arphamenine oldat pH-jàt Dowex WGR-rel 5-ös értékre állítjuk be, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 94 mg Arphamenine A-t nyerünk fehér por formájában, aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,0054 Mg/ml. 5. példa A 3. példa szerint elöállitott Arphamenine B anyagból 79 mg-ot megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldunk, pH-ját 1 n sósavval 2,3-ra állítjuk be, majd CM-Sephadex C-25 töltetű oszlopon kromatografáljuk és végűi 100 ml 0,15 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 350 ml 0,15 mólos nátrium-klorid oldattal és 350 ml 0,6 mólos nátrium-klorid oldattal végezzük. Az eluálásnál 11 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az Arphamenine B-t a 17-30. frakciók tartalmazzák. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük, Sephadex LH-20 töltetű oszlopon sótalanitjuk, az eluálást 0,01 n sósav oldattal végezve. A tisztított Arphamenine B frakciókat tartalmazó oldat pH-ját Dowex WGR-rel 5-re állítjuk be, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 32 mg Arphamenine B-t nyerünk fehér por formájában, aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,0020 Mg/ml. 6. példa 500 ml-es Sakaguchi edénybe 80 ml 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,5% hallisztet, 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló (KM-72) anyagot (gyártó: Shinetsu Kagaku, Tokió, Japán) tartalmazó tápközeget helyezünk, majd 120 °C-on 15 percig sterilizáljuk. Ezután lehűtjük, és kacsnyi mennyiségű Chromobacterium violaceum (régi deponálási szám FERM-P 6521, új deponálási szám: FERM-BP-286, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan) ferdetenyészettel beoltjuk. A primer oltóanyag előállítása érdekében a rázótenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 órán át végezzük, percenként 135 rázással. 100 literes tartályba 50 liter, 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5 Prorich-t, 1,74% bonito extraktumot, (beszerezhető: Yaizo Suisan Kagaku, Shizuoka, Japán) 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló anyagot (KM-72) tartalmazó tápközeget helyezünk, 120 °C-on 30 percig sterilizáljuk, lehűtjük, majd 80 ml fenti primer oltóanyaggal beoltjuk. A beoltott tápközeget 24 órán át 28 °C-on tenyésztjük, 200 fordulat/perc forgatás és 50 liter/perc steril levegő adagolása mellett. Ily módon nyerjük a szekunder oltóanyagot. 300 liter 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-sikér-lisztet, 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló anyagot (KM-72) tartalmazó tápközeget 570 literes tankba helyezünk, 120 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk, lehűtjük, majd 6 liter fenti szekunder oltóanyaggal beoltjuk és a tenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 órán át 19Ó fordulat/ percnél végezzük. A tenyésztés után a tenyészet pH-ját kénsavval 2-es értékre állítjuk be, és leszívatással (Hyflo-Super Cell-en) leszűrjük. A szűrlet pH-ját nátrium-hidroxiddal 6-ra állítjuk be, majd ismét szűrjük. Az Így kapott szűrletet aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,17 Mg/ml* 185 liter fenti szürlethez 10 liter aktiv szenet (kromatográfiás tisztaságú) adunk, az anyagot 2 órán át keverjük, majd az aktiv szenet leszűrjük (200 mesh lyukbőségű szitán). Az aktív szenet ezután 50 liter vízzel mossuk, majd hozzáadunk 80 liter sósavval 2-es pH-ra beállított 50%-os vizes aceton oldatot. A keveréket 2 órán át keverés közben extraháljuk, majd az aktív szenet centrifugálással eltávolítjuk, és az extraktumot 3,54 literre töményitjük. Az így nyert anyag aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,0063 Ml/mg. 7. példa A 6. példa szerint előállított 3,54 liter mennyiségű koncentrátumot 2 n nátrium-hidroxiddal semlegesítve 5,35 literre egészítjük ki. Ezt a folyadékot ezután 1,7 literes Amberlite XAD-4 töltetű oszlopon engedjük át, az oszlopot vizzel mossuk és 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. A 7 literes aktív frakciót csökkentett nyomáson 280 ml-re töményitjük be (aminopeptidáz B-gátló hatása, IC»: 0,01 Ml/mg), majd a koncentrátumot 1,7 literes CM-Sephadex töltetű oszlopon kromatografáljuk, 6 liter 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldattal, majd 2 liter 0,05 mólos citrát pufferrel (pH=4,5) mossuk. Ezután az oszlop eluálását 6 liter fenti puffer oldattal és 6 liter 0,6 mól nátrium-kloridot is tartalmazó fenti puffer oldattal végezzük. Az eluátumot 200 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine A-t a 30-39. frakciók, az Arphamenine B-t a 42-52. frakciók tartalmazzák. Az egyes frakciókat összegyűjtve és Amberlite XAD-4- -gyel sótalanitva, 85 ml Arphamenine . A-t (ICso: 0,00058 pl/ml) és .43 ml Arphamenine B-t nyerünk (ICso: 0,00031 Mg/ml). 8. példa 85 ml 7. példa szerint előállított Arphamenine A frakciót 240 ml-es Biogel P-2 töltetű (gyártó Bio-Rad) oszlopon kromatografalunk. Az oszlopot ezután 2 liter vízzel mossuk, majd 1 liter 20%-os vizes metanollal, majd ezt követően 0,005 mólos vizes nátrium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
